迅速、高感度、低騒音 | 南寧ピーコックプライド株式会社

Scientific Reports volume 12、記事番号: 7741 (2022) この記事を引用

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3 引用

2 オルトメトリック

メトリクスの詳細

不適切な飲料水の質は、主に幼児における予防可能な死亡の主な原因の 1 つです。特に資源が限られている場合、汚染水源を特定することは依然として大きな課題です。 WHO が水の糞便汚染を測定する指標として推奨している大腸菌 (E. coli) を測定する現在の方法では、一晩の培養が必要であり、専門的な訓練が必要です。 2016 年、ユニセフは、野外の水サンプル中の低レベルの生存大腸菌を 6 時間以内に検出するための製品革新を奨励するために、ターゲット製品プロファイル (TPP) を発表しました。この課題に突き動かされて、私たちは大腸菌を検出して半定量するためのファージベースのアッセイを開発しました。私たちは、広範な細菌株ライブラリーに対して選択され、高感度の NanoLuc ルシフェラーゼレポーターと組み換えられた合計 8 つのファージを含むファージカクテルを配合しました。このアッセイは、社内で設計されたマイクロ流体チップで処理されるように最適化されており、地元の下水サンプルとケニアのナイロビの飲料水源に対してテストされました。このアッセイをマイクロ流体チッププラットフォームと組み合わせて、最小限の訓練を受けた担当者が5.5時間で10 MPN/100 mL未満の大腸菌を検出および半定量する完全自動ソリューションを提案します。

安全な飲料水への持続可能なアクセスの重要性は、貧困を削減し、世界人口の健康と幸福を改善するために引き続き重要です。持続可能な開発目標と安全な水へのアクセスの増加に焦点を当てた開発目標（SDG 6）1に向けて進展は見られましたが、多くの水供給の質は依然として不確実です。主に汚染された食品や水が原因の下痢性疾患は、引き続き5歳未満の子供の死亡原因として世界で2番目に多く、世界全体の死亡者数の8％を占め、死亡者数の80％は南アジアとサハラ以南で発生しています。アフリカ２．下痢の原因となる病原菌が存在していないか水質を検査することは、何百万もの人々の健康にとって不可欠です。

最も重大な微生物リスクの 1 つは、人間または動物の糞便で汚染された水の摂取に関連しています 3。ほとんどの大腸菌群は人間には無害ですが、危険な病原体の存在の可能性を示す検査に利用されます。特に大腸菌は、ほぼヒトおよび動物の糞便に由来し、少数の病原菌株（O157:H7 など）を含むため、指標微生物として理想的な特徴を多く備えています4。糞便指標（大腸菌群、耐熱性大腸菌群、大腸菌）の使用は、それらの存在が病原体の存在リスクが増加していることを意味するだけであるため批判されていますが、数百の既知の水系病原体を監視することは依然として非現実的であり、迅速に行うことは非常に困難です。そして低コスト4．さらに、汚染レベルが上がるにつれて水系感染症にかかるリスクが高まるため、糞便指標の量に関する情報も不可欠です。

細菌の許容限界値は、特に WHO3 によって定義されており、飲料用に使用されるすべての水には、100 mL のサンプル中に検出可能な大腸菌または耐熱性大腸菌群が存在してはならないと規定されており、現在では大腸菌が好ましい指標となっています。水サンプル中の大腸菌群を検出するために最もよく使用される方法は、膜濾過、最確数 (MPN) 法を使用した多管発酵、および硫化水素試験などの有無試験です。これらの方法は、1 テストあたり 0.5 ～ 7.5 ドルで 1 CFU/100 mL の感度を達成できますが、多くの場合、手間がかかり、専門スタッフのトレーニングが必要で、現場での使用が難しく、長いインキュベーション時間 (通常は一晩) が必要です6。水中の低レベルの生存可能な大腸菌を 8 時間以内に迅速に検出できる検査はありません。

ユニセフの製品イノベーションチームは、地域社会や政府パートナーに水質に関する重要な情報を提供し、汚水を処理し、水汚染の改善領域を特定できるようにするための新製品の開発を促進するために、大腸菌の迅速検出プロジェクトを立ち上げました。したがって、ユニセフは、できるだけ早く糞便汚染を正確に判定する製品を開発するよう業界を指導するために、ターゲット製品プロファイル（TPP）を発表しました8。

新世代のアッセイでは、遺伝子操作されたバクテリオファージを使用して病原体を検出します9、10。ファージは細菌内で感染して増殖するウイルスであり、生物圏で最も一般的で多様な存在の 1 つです。それらは、ファージ付着タンパク質と細菌細胞表面の間の複雑な相互作用により、特定の宿主範囲を示します11。ファージは、ファージ複製中に細菌内で発現されるレポータータンパク質の遺伝情報を運ぶように遺伝子組み換えすることができます。検出方法としてレポーターファージを使用すると、リステリア 12、マイコバクテリウム 13、サルモネラ菌 14、大腸菌 15 などの病原体を検出できることが以前に実証されています。一般的に使用されるレポーターには、アルカリホスファターゼ 16、緑色蛍光タンパク質 (GFP) 13、細菌ルシフェラーゼ (lux システム) 12、17、および NanoLuc® ルシフェラーゼ 18、19、20 などがあります。 NanoLuc ルシフェラーゼは、他のルシフェラーゼよりも 100 倍強い発光シグナルを生成し、基質フリマジンに依存して安定したグロー型発光を生成する小さなタンパク質 (19 kDa) です 21。

ここでは、NanoLuc ルシフェラーゼレポーターファージのカクテルを使用して、水中の大腸菌汚染を特異的に検出します。当社は、水 100 mL 中の MPN 大腸菌 10 個未満を 5.5 時間で検出できる、非常に高感度かつ迅速なアッセイを開発しました。これはユニセフの TPP 要件を満たしており、同日の検査が可能です。ファージカクテルには幅広い大腸菌宿主範囲があり、あらゆる水源でアッセイを使用できます。最後に、アッセイは、現場で使用するための自動機器プロトタイプ (濾過ユニット、液体処理ユニット、検出ユニット) 22 と統合するように設計されたマイクロ流体チップで実行されます。使い捨てマイクロ流体デバイスの総コストは 1 ドル未満で、関連する機器はユニセフ TPP8 で定められたコスト目標を満たしているため、このプラットフォームは現在の大腸菌フィールド検査キットの適切な代替品となっています。

バクテリオファージ T4 では、Hoc (高抗原性アウターキャプシドタンパク質) は高度に発現される非必須キャプシド装飾タンパク質 23 であり、この遺伝子座を使用してファージのゲノムにタンパク質を挿入することに成功しています 24。同様のタンパク質が多数のバクテリオファージおよび二本鎖ウイルスで同定されています 25、26、27、28。当社のファージライブラリのゲノム配列分析により、BW-1、HER252、Phi3、RB69、T7、TH07、およびTH09を含むいくつかのゲノムにHocホモログが存在することが示され、セルロースに融合されたNanoLucレポーターの挿入部位として使用されました。 -結合モチーフ (CBM) 発現カセット。図1aに示すように、T7とTH09を除くすべてのファージの操作にはCRISPR/Cas9システム29、30、31を使用しました。これらのファージについては、より単純な相同組換えのみで組換えDNAをファージゲノムに導入するのに十分でした。

(a) CRISPR-Cas9 システムを使用した生体内ファージ組換えの概略図。宿主細菌細胞は、ファージに対する左右の相同領域（LHRおよびRHR）に隣接するレポーターNanoLuc-CBM、および選択されたcrRNAおよびスペーサー配列を含むドナープラスミドで形質転換されます。 (b) ファージプラークアッセイは、細菌叢内のプラークの存在 (上の写真) と、暗室で画像化した場合のプラーク内の NanoLuc 活性 (下の写真) を示します。 BioRender.com で作成されました。

pCas9 プラスミドは、ネイティブプロモーターから化膿連鎖球菌 Cas9 および tracrRNA を発現し、Lac プロモーターの下流の合成配列は crRNA リーダー配列とダイレクトリピートに隣接する 3 つのスペーサーを構成的に発現します。特定のファージの hoc 遺伝子座に向けられた複数のスペーサーの使用には 2 つの要素があります。 (1) 1 つの遺伝子座に向けられた複数の gRNA により、Cas9 を介した標的ファージの切断頻度が最大化されます (2) hoc 遺伝子座内の配列保存により、1 つの合成配列を使用して複数のファージ (1 つまたは 2 つの保存されたスペーサーを含む) を操作することが可能になります。

gRNA の性能は、Cas9 のみを発現する株と比較した、Cas9 と gRNA の両方を発現する株におけるファージ力価の対数減少として定義されるプラーク形成効率 (EOP) を測定することによって決定されました。 3 以上のプラーク形成効率は、CRISPR/Cas9 システムが期待どおりに機能していることを示し、組換えファージを生成するために gRNA が選択されました (表 S2)。相同組換えの成功は、組換えファージによって形成されたプラーク中のNanoLuc活性および配列決定によって確認された(図1b)。驚くべきことに、TH09組換えファージの構築中に単離されたNanoLuc発現ファージの1つは、親TH09ファージ配列に対して限定的な相同性を示した。我々は、その元の親ファージが非常に低濃度で存在し、TH09 ドナープラスミドと相同な領域で組換えを受け、NanoLuc 活性に基づいて選択されたと仮説を立てています。配列比較により、それが T4 様ファージであることが示されました。このファージはPJ133と名付けられた。

レポーターの発現を駆動するプロモーターの性質により、NanoLuc はファージの増幅中に構成的に発現されて高力価試薬を生成し、その後のアッセイにおけるバックグラウンドシグナルに寄与します。したがって、下流アッセイの感度を向上させるために、レポーターを精製する方法を開発しました。

ファージ T7 は、NanoLuc に融合されたセルロース結合モジュール (CBM) を利用し、セルロースベースのビーズによる連続洗浄を使用してレポーターを結合および除去することによって精製されました。この方法は当初、すべての組換えファージに使用することを意図していましたが、他のファージには効果がありませんでした。我々は、一部のファージがビーズに結合して精製ファージ溶液の最終力価が低くなり、場合によっては、ファージ Phi6 で観察されたように、レポーターが低効率でビーズに結合し、その結果高いバックグラウンドシグナルが発生するという仮説を立てました。。 500 kDa カットオフ膜を備えたカートリッジを使用するタンジェンシャルフローフィルトレーション (TFF) は、これらのファージ溶液からレポーターを除去するための信頼できる方法であることが証明されました。ろ過は、発光値が 1000 RLU 以下で頭打ちになるまで 12 ～ 18 時間実行しました。濾過効率は、細菌細胞の増殖およびファージの増殖中に培地に界面活性剤 (0.05% tween 80) を添加することによって一貫して改善されました 32。最大 0.3% の Tween 80 濃度は細菌の増殖とファージ感染に影響を与えませんでした (図 S1)。

図2aの概略図に記載されているいくつかのステップに続くファージダウンセレクションプロセスを使用して、ファージカクテルの最終組成を決定しました。

(a) ファージ選択プロセスの説明: 1. 大腸菌ライブラリーのサブセット (79 株) に対してファージライブラリー全体 (92 株) を使用してプラークアッセイを実行します。補足ファイル 2 には、詳細なプラークプラークデータが含まれています。2. 計算された追加宿主範囲に基づいてファージがダウンセレクションされます (20 株)。3. NanoLuc レポーターとの組換え効率に基づいてファージがさらにダウンセレクションされます (10 株)。4. 発光アッセイのパフォーマンス大腸菌ライブラリ全体 (339 株) に対する分析、精製の成功、および全体的な安定性を評価して、最終的なファージカクテル組成 (8 株) を決定します。 (b) ファージ感染時にプラークを生成する細菌の割合。 (c) 発光アッセイによって決定された組換えファージに感受性のある大腸菌株の割合。一致する株のプラークアッセイの結果と比較すると、発光アッセイの宿主範囲は一般に広いです（挿入図は例を示しています。図S2にはファージの完全なリストがあり、補足ファイル2には一致する株の直接比較が示されています）。

最初のステップでは、ECOR ライブラリーの前半 (株 #1 ～ #36)33 および 43 の環境株からなる大腸菌株のサブセットに対するプラークアッセイによって、ライブラリーからの 92 ファージの宿主範囲をテストしました。この実験では、宿主株の芝生内で観察されたプラークの形成により、宿主内でのファージの複製と増殖、つまり試験した細菌株の感受性が実証されました。ファージは宿主感受性に大きなばらつきを示し、一部のファージは広範な宿主範囲を示します。たとえば、宿主株の25％以上がTH09ファージとHER259ファージの両方に対する感受性を示しましたが、14のファージは試験した79の細菌株のいずれにもプラークを形成しませんでした（図2b、表S4、S5、および補足ファイル2）。ファージの個々の宿主の範囲の広さと、組み合わせて使用したファージの計算された追加の範囲に基づいて、遺伝子操作するために 20 個のファージが選択されました。

NanoLuc 酵素レポーターは 12 のファージのゲノムに正常に導入され、その宿主範囲は大腸菌株社内ライブラリー全体 (メソッドに記載され、表 S2 および表 S3 にリストされている 339 株) に対する発光アッセイを使用して評価されました。ハイスループットスクリーニングにさらに役立つ発光アッセイでは、大腸菌宿主と組換えファージの両方を含むウェルからのシグナルを、組換えファージのみを含む対照ウェルと比較しました（図2c）。陽性の宿主感受性は、平均バックグラウンド値 +3 標準偏差 (SD) を超える発光を示すすべてのウェルで記録されました。一致する株のプラークアッセイと発光アッセイで得られた結果を比較すると、発光アッセイに基づく宿主範囲が一般的により広く、追加の宿主範囲感受性を示すことに気づきました（補足ファイル2）。たとえば、この観察はファージ HER252、BW-1、および PJ133 で明らかであり、宿主範囲がそれぞれ 49%、57%、および 75% 増加しました (図 2c、挿入図および図 S2 は残りの部分を示しています)ファージ）。遺伝子操作されたファージと野生型ファージの間でプラークアッセイによって測定された宿主範囲の比較をファージT2についてテストしたところ、宿主範囲の違いは示されず、宿主範囲の変化がファージのゲノムの操作によるものではないことを示唆しています。さらに、操作されたファージ PJ133 の宿主範囲は、プラークアッセイよりも発光によって評価した場合の方が広い (補足ファイル 2)。

選択されたファージのリストは、溶解時間、レポーター生産効率、精製ファージ溶液の安定性などのいくつかの要因に基づいてさらに絞り込まれ、高い力価 (> 109 PFU/mL) と低い発光バックグラウンドを持つファージを組み合わせるという目標を達成しました。比較的高速（< 3 時間）で高発光シグナルの発現を誘導し、4 °C で安定です。たとえば、レポーターファージ Phi7 と T7 は同様の発光ベースの宿主範囲を持っています。ただし、T7 は 2 時間早く陽性の発光シグナルを生成し、ファージ Phi7 よりも選択されました。ファージ T2 の力価は、4 °C での保存中に数週間で数対数減少したため、カクテルの候補としては追求されませんでした。同様に、ファージ T6 の力価は遠心分離ステップ中に低下することが判明し、精製中の安定性がより良い他のファージを優先して優先順位も下がりました。最後に、ファージ Phi6 は、精製効率が悪く、高い発光バックグラウンドレベルをもたらしたため、プロセスの初期に除去されました。

ファージ操作および選択プロセスの最後に、BW-1、HER252、Phi3、PJ133、RB69、T7、TH07、および TH09 の 8 つのファージを含むファージカクテルが開発されました。選択したファージについての大腸菌株ライブラリー全体に対する発光アッセイに基づく宿主範囲試験の結果を図 2c に示します。宿主範囲の範囲は 27% (T7) から 70% (BW-1) まで変化し、さまざまなファージからの負の干渉がないと仮定すると、ライブラリーの合計は 90% になります。

実験用株 ATCC 25922 は、米国 EPA によって飲料水の分析用に QC 株としてリストされているため、8 つのファージのカクテルを使用して、細菌の検出限界が最も低くなるまでのファージ感染期間を決定するために選択されました。この株はファージ HER252、BW1、および PJ133 に対して感受性があり、ファージ BW1 がより強い発光シグナルを誘導します (図 S3)。ファージがカクテル中にある場合、最も強いシグナルを誘導するファージによってシグナルが支配されることが観察されました。定常期の細菌細胞の段階希釈物をまず、96 ウェルプレートの増殖培地中で 37 °C で 2 時間インキュベートして、ファージカクテルを添加する前に細胞を回収し、タンパク質発現の準備を整えました。

ファージ感染ステップでは、細菌をファージとともに 1、1.5、2、または 2.5 時間インキュベートした後、発現した NanoLuc レポーターを濃縮し、結果として生じる発光シグナルを測定しました。シグナルは、ファージカクテルのみによって生成されるバックグラウンド発光に対して正規化され、いくつかの細胞濃度での異なる感染時間について比較され、各条件に対応する検出限界が決定されます（図3）。 MPN (Most Probable Number) 値は、Quanti-Tray/2000 システムによって 3 回測定された、ウェルごとに追加された細胞の数を表します。ファージと細菌細胞間の接触時間が増加すると、バックグラウンドを超えるシグナル検出の限界が減少します。たとえば、1 時間、1.5 時間、および 2 時間のインキュベーション期間では、それぞれ 60、20、および 8 個の細胞からバックグラウンドを 2 倍上回るシグナルが得られます。合計 4 時間のインキュベーション後の追加のインキュベーション時間では、試験した細胞数の範囲を超えてシグナルは増加しません。

ATCC 25922 および 8 ファージカクテルを使用した 1、1.5、2、および 2.5 時間のファージインキュベーションにおける MPN/ウェルの関数としてファージのみのバックグラウンドに正規化された四分位範囲の 8 複製の発光シグナル中央値。 MPN 値は、Quanti-Tray/2000 によって 3 回測定されました。破線は、2×バックグラウンドでの値を表します。

ATCC 25922 株では、2 時間後にシグナルがプラトーに達することが観察されるため、細菌をファージと 2 時間以上インキュベートしても利点も欠点もないようであることに注意してください。したがって、特徴付けられていない細菌集団を含むフィールドサンプルとマイクロ流体デバイス 22 内でのその後の実験では、ファージのインキュベーション時間を 3 時間にして、すべての細菌が酵素レポーターを生成する時間を確保します。

我々は、カクテル用のファージを選択するために、広い地理的 (表 S2 および表 S3) および遺伝的多様性を持つ大腸菌ライブラリーを組み立てました 33。しかし、私たちは、このファージ選択プロセスが私たちのコレクションに特有の細菌集団に偏っているかどうかを、カクテル形成の早い段階で評価したいと考えました。したがって、このフィールド評価の時点では、私たちのカクテルは開発の初期段階にあり、4 つのファージ、つまり Phi3、Phi7、RB69、および T7 を含んでいた。予備ファージカクテルの性能は、以前の研究で説明したように、アッセイの手動ステップを置き換えるように設計された初期のマイクロ流体チッププロトタイプと組み合わせてテストされました22（図4a）。このチップには、細菌が捕捉され、ファージに感染し、レポーターが発現される最初の膜が組み込まれています。デバイス内の 2 番目の膜は、発現されたレポーターが濃縮されて検出される場所です。ファージベースのマイクロ流体アッセイの性能は、ケニアのナイロビ市を流れるゴン川から収集された現地のサンプルでテストされました。一般に、サンプルは非常に濁っており、高度に汚染されていました。一連の細菌濃度を評価するために処理する前に、サンプルの希釈液を滅菌蒸留水で調製しました（図 4b）。

地元の下水サンプルに対する予備的なファージカクテルアッセイの検証。 (a) 水サンプル中の大腸菌を検出するためのマイクロ流体デバイスの最初のプロトタイプ。スケールバー: 10 mm (b) 4 つのファージ (Phi3、Phi7、RB69、および T7) のカクテルを使用して取得され、マイクロ流体チップデバイスを通じて処理された水サンプルのファージのみのバックグラウンドに対して正規化された発光シグナル。水サンプルはナイロビ市を流れるゴン川から採取されました。 CFU 値は、膜濾過フィールドキットを使用して決定されました。破線は、2×バックグラウンドでの値を表します。

マイクロ流体チップへの流体の追加は、必要な試薬を含むピペットチップと真空源に接続されたチューブのためのインターフェースを提供する入口/出口ポートを囲む使い捨てのシリコーンゴム固定具を使用して手動で実行されました。出口ポートに接続された真空源を使用して、マイクロ流体デバイス内の流体の流れを制御した。この実験では、処理された水の量は 10 mL でしたが、これは以前の研究で 100 mL のサンプル量中の同じ数の細菌と同等の結果が得られることを示しました 22。アッセイは合計 5 時間実行され、細胞が NanoLuc レポーター酵素を産生するのに十分な時間を確保するために、2 時間の細菌回復期間とそれに続く 3 時間のファージ感染に分割されました。

結果から、9 CFU を含む試験サンプルの両方と、8 CFU を含む 2 つのサンプルのうち 1 つについて、バックグラウンドを超える明確なシグナルが観察されました (図 4)。これらの結果は、4 ファージカクテルを使用すると、水 100 mL あたり 10 未満の大腸菌 CFU をすでに測定できることを示しています。また、ここで参照方法として使用される濾過検査キットは、特に大腸菌ではなく耐熱性大腸菌群の存在を検出し、耐熱性大腸菌群の約 80% のみを検出することに注意してください 34, 35。さらに、非耐性大腸菌群は約 15 ～ 20 倍存在します。 E. サンプル中の大腸菌数は、我々がサンプルを処理したナイロビの AgriQ Quest Laboratory で実施された総プレート数によって決定され、糞便汚泥の細菌集団におけるエシェリヒア/シゲラ属の相対存在量は 0.1 ～ 0.8% と推定されています。 36. これは、このアッセイでは大腸菌以外の細菌は検出されず、ファージの宿主範囲が大腸菌に特異的であることを示しています。 96 ウェルプレート形式で河川サンプルに対して実行した実験でも同様の結果が観察され、より多くのサンプルと反復をテストすることができました (図 S4)。私たちの大腸菌ライブラリーが十分に多様であることを確認したこれらの予備的な結果に基づいて、宿主範囲と検出下限を増加させた、潜在的により堅牢なアッセイを設計するために、ファージカクテルの開発をさらに追求しました。テストの時点では、ファージ Phi7 がカクテルの一部でしたが、後にカクテル全体のパフォーマンスが向上しないことが判明し、よりパフォーマンスの高いファージを優先して削除されたことに注意してください。

8 個のファージを含む完成したファージカクテルを、地元の水処理場 (米国ワシントン州レントンにあるキング郡南水処理場) で収集された下水サンプルでチャレンジしました。部分カクテルのフィールド評価に関しては、社内設計のマイクロ流体チップを使用してアッセイを実行しました。今回は、図5aに示し、以前の研究でさらに説明されている更新バージョンを使用しました22。新しいバージョンのマイクロ流体デバイスには、以前のバージョンと同じ機能ユニットがすべて含まれています。ただし、射出成形による製造プロセスを可能にするために小さな変更が加えられ、テスト全体のコストが大幅に削減されました。下水サンプルのいくつかの希釈液を二重（MPN 値 > 1000）または三重（MPN 値 < 1000）で調製して、試験用の細胞濃度範囲を生成しました（図 5b）。

地元の下水サンプルに対する最終ファージカクテルアッセイの検証。 (a) 水サンプル中の大腸菌を検出するためのマイクロ流体デバイスの 2 番目のプロトタイプ。スケールバー: 10 mm (b) 8 ファージカクテルを使用して取得され、マイクロ流体チップデバイスを通じて処理された下水サンプルのファージのみのバックグラウンドに対して正規化された発光シグナル。 MPN 値は、Quanti-Tray/2000 アッセイで測定されました。点線は、MPN 値 1 ～ 100 の間で、データのサブセットに対して実行された線形回帰を示しています。破線は、2 × バックグラウンドでの値を表します。

ここに示したデータは、2 つの異なる日に収集された下水サンプルで得られた結果を集計したものであり、差異は観察されませんでした。 x 値 < 1 は、メーカーの指示に従って割り当てられた最確数 (MPN) 値が 1/100 mL 未満である陰性の Quanti-Tray/2000 アッセイに対応します。これらのサンプルでは、測定された発光シグナルは、ファージのみのコントロールからのバックグラウンドシグナルに匹敵します。 MPN 値 1 (メーカーが記載する 95% 信頼区間 (CI) = 0 ～ 3.7) では、ファージアッセイでは 3 サンプル中 1 サンプルのみでバックグラウンドの 2 倍を超えるシグナルが検出されます。非常に低い細胞濃度では、細菌集団はポアソン分布に従います 37。これは、希釈サンプルの一部には細胞が含まれる可能性があり、他のサンプルには細胞が含まれない可能性があることを説明します。ただし、MPN 値 6 では、ほとんどのサンプルに細菌が含まれていることを示す 95% CI = 2.3 ～ 12.1 で、3 回の反復すべてでバックグラウンドを約 5 倍上回るシグナルが検出されます。アッセイの簡単な検量線を示すために、より低い細胞数範囲 (< 100) のみで線形回帰を実行しました。これにより、アッセイで測定された発光応答に基づいて細菌数の範囲を決定できます: < 1、1 ～ 10、10 ～ 100、および > 100。

汚染された水源を特定するには、資源が少ない状況で水源中の病原体の存在を示す、迅速かつ低コストで実践可能な方法が必要です。大腸菌汚染を定量化するための検査を行うことが多い政府機関や非営利団体が現在利用できる方法には、通常、長い潜伏期間と複雑なプロセスが含まれます。さらに、専門的なトレーニングが必要であるか、サンプルを実験室で輸送して処理する必要があります。残念ながら、近くに必要なインフラが不足しているため、これは実現できないことがよくあります。

大量の水 (100 mL) 中の低レベルの生存可能な大腸菌を検出するための迅速かつ低コストの検査の設計は、科学界にとって困難であることが証明されています。これまでの取り組みは、この応用のためのレポーターファージの開発に成功してきた18、38、39。残念ながら、この方法では宿主範囲とアッセイプロトコルが非常に限られた実験室株とファージを使用するため、野外応用には適していません。このギャップに対処するために、私たちは、この研究のために単離された50を超える新規ファージを含む92のファージのライブラリーをスクリーニングし、さまざまな場所から採取した現実世界の環境水サンプルを対象に、以前に研究室で開発したマイクロ流体デバイスの性能を検証しました。私たちの全体的な手法は以下を組み合わせています。

大腸菌に特有の広範な宿主範囲を含むファージカクテル。

酵素レポーターである NanoLuciferase は、NanoGlo 基質と組み合わせると非常に明るい発光シグナルを生成し、低い検出限界を実現します。

検出前のアッセイの感度を高めるために、細菌濃縮ステップ、その場ファージ感染、発現レポーターの濃縮を組み合わせた使い捨てマイクロ流体デバイス。

アッセイ開発に向けた最初のステップとして、さまざまな特性 (NanoLuc レポーターとの組み換えの容易さ、精製プロセス中および精製後の安定性、最終的なファージの純度および力価、シグナル生成の時間、および感染に起因する発光シグナルの強度）をファージカクテルに組み合わせる。ファージを選択するための大腸菌株ライブラリーの構築は、限られた資源環境で単離された株に偏った遺伝的および地理的多様性に基づいていました。ファージの安定性や精製プロセスの成功を予測する方法が見つからなかったため、ファージの選択プロセスは経験的データに基づいていました。宿主範囲の決定中に、試験したすべてのファージについて、発光アッセイによって決定された宿主範囲は、プラークアッセイによって決定された場合よりも広いことが観察されました。我々は、この違いは、感染した細菌細胞が早期に死滅し、それによって成熟ファージの産生とさらなる増殖が妨げられる不育症感染の結果であると仮説を立てています40。持続的な感染は発生せず、プラークは観察されませんが、レポーター酵素は検出されるのに十分なレベルで生成されます。あるいは、プラークアッセイの変更（例、軟寒天オーバーレイの低濃度）はプラークの形態に影響を与える可能性があり、プラークと発光アッセイの結果が一致するかどうかをさらに調査する予定です。

レポーター酵素の発現は構成的プロモーターによって制御されるため、ファージの増殖中に生成されます。その結果、我々は、実質的なバックグラウンドシグナルを生成しない、高力価かつ低レポーター濃度のファージ試薬を生産する精製方法の開発に多大な努力を注ぎました。連続したセルロースビーズ精製ラウンドを使用して、ファージ T7 のみを効率的に精製できました。この方法では、セルロースベースのビーズが、NanoLuc レポーターに融合されたセルロース結合モチーフ (CBM) に結合し、溶液から除去できます。他のすべてのファージは力価が低下するか、NanoLuc タンパク質のかなりの部分がビーズに結合せず酵素活性が残るため、残留発光が許容できないほど高い値で頭打ちになります。タンジェンシャルフローろ過などのサイズ排除ベースの方法は、このような場合に効果的であることが証明され、大量の処理が可能になりました。

生菌を測定するアッセイでは、回復と増殖の期間を経ている細菌はより高いシグナルを生成するため、通常、検出までの時間と検出限界の間にはトレードオフがあります。水環境は栄養分が少なく、哺乳類の消化管よりも温度が低いため、環境水サンプルから収集された細菌細胞は休眠状態にあると予想されます。定常期の細菌細胞を最適温度の栄養豊富な培地に置くと、細胞はまず誘導期に入ります。これは、細胞が新しい環境に適応し、指数関数的な増殖の準備をする最初の期間です 41。したがって、細胞がレポーター酵素を効果的に発現するには、細胞がタンパク質が高レベルで発現される指数関数的増殖期に入っていることを確認する必要があります。マイクロ流体デバイス内で行われた以前の研究 22 に基づくと、細胞代謝回復の 1 ～ 2 時間は、効果的なファージ感染を確実にするために必要な最小限の時間でした。水サンプルには回復時間が異なる可能性のあるさまざまな細菌株が含まれていると予想されるため、ファージ感染前に 2 時間のインキュベーション期間を選択しました。次に、ファージ感染後の最大シグナル生成が観察される時間を決定しました。 8 つのファージと実験室株のカクテルを使用して、2 時間のファージ感染後に最大のシグナル生成が観察され、感染時間が長くなると頭打ちになります。より長い感染時間による悪影響は観察されず、ファージが環境サンプルからの特徴付けられていない細菌集団に感染すると予想されるため、感染時間を 3 時間に選択し、アッセイの合計インキュベーション時間は 5 時間となりました。

私たちは、この製品の使用が予定されているケニアのナイロビで実際のサンプルでアッセイをテストすることにより、開発の初期段階でアッセイの性能を評価し、ファージ選択方法を検証しました。この評価は、カクテルの性能を適切に評価し、ファージ選択法の妥当性を確保するために重要です。この評価の時点では、ファージカクテルには 4 つのファージ (Phi3、Phi7、RB69、および T7) が含まれていました。わずか 4 つのファージを使用したこのアッセイは、これらの環境サンプルに対して非常にうまく機能し、100 mL あたり 10 個未満の大腸菌 MPN を検出しました。さらに、耐熱性大腸菌群 CFU が 1 以下のサンプルではバックグラウンドを超えるシグナルがほとんど観察されず、このアッセイが大腸菌に特異的であることが示されました。これらの結果を総合すると、当社の社内大腸菌ライブラリーを使用すると、当社の大腸菌ライブラリーに特異的なだけでなく、広範囲の細菌に感染する宿主範囲を持つファージを選択できることが実証されました。これらの結果に基づいて、ファージカクテルとアッセイの開発を進めました。新しいファージをカクテルに徐々に加えた場合、阻害効果は観察されなかったことに注意してください。したがって、より多くの数のファージを含むカクテルが望ましい。これは、水サンプル中で感受性の高い大腸菌株を見つける可能性を高めるためである。

複雑な細菌サンプルおよびマイクロ流体チップデバイスに対するファージベースのアッセイの性能とファージカクテルの組成をさらに検証するために、地元の水処理プラントから水サンプルを収集しました。これらの結果は、Quanti-Tray/2000 参照メソッドと比較して、このメソッドが 5.5 時間 (インキュベーション期間、濾過、およびレポーター濃縮ステップを含む合計時間) で 6 E. coli MPN までの大腸菌細胞を検出することを示しています。さらに、シグナルは細菌数に応じて直線的に変化するため、検量線に当てはめることができます。これにより、汚染レベルを決定できます。< 1 大腸菌 MPN/100 mL (汚染なしから非常に低い汚染)、1 ～ 10 大腸菌 MPN/100 mL (低汚染)、10 ～ 100 大腸菌 MPN/100 mL (高汚染)、> 100 大腸菌 MPN/100 mL (非常に高汚染)。この検量線はファージ試薬の品質 (力価、純度) に依存しており、ファージカクテル製造ロットごとに決定する必要があります。

マイクロ流体チップデバイスとともに使用するために、私たちの研究室は、最小限のトレーニングを受けたユーザーがファージベースのアッセイを実行できる機器を設計しました。機器とソフトウェアの設計は、Alonzo et al.22 による以前の出版物で利用可能になりました。この機器と併せて、当社は、関連する大腸菌の細菌汚染レベルを 1/100 mL 未満、1/100 mL 未満、1/100 mL 未満の関連する大腸菌の細菌汚染レベルを区別しながら、野外で 100 mL あたり 10 個未満の生存大腸菌 MPN を 5.5 時間で特異的に測定する完全なソリューションを提案しています。既存のフィールドテストキットと同様のコストで、10/100 mL、10 から 100/100 mL の間、および 100/100 mL 以上のテストが可能です。

リモートアクセスを容易にするために、プロトタイプは機内持ち込み手荷物サイズの小さなペリカンケースに収まり、軽量で、バッテリー駆動が可能です。計測プロトタイプをさらに開発して自動化を追加し、スループットを向上させることで、最小限のトレーニングを受けたユーザーによる遠隔地でのテストが可能になります。試薬の安定性とパッケージング、特にファージと基質溶液の凍結乾燥に関するさらなる開発努力は、ポータブルシステムの可能性を高めるために興味深いものである。ファージの選択を改良して堅牢なカクテル組成物を生成し、高い感度と特異性を達成するには、さまざまな場所の天然水でアッセイをテストする必要があります。あるいは、最初の結合事象に関与するファージ尾部成分の指向性遺伝子改変により、宿主範囲を拡大することに成功した42。これらの戦略は、尿や飲料などの他の液体サンプル中の他の病原体や指標の検出を目的とした特定のバクテリオファージの設計にも利用できます。

当社の細菌コレクションは、ミシガン州立大学から購入した ECOR ライブラリー 33 に代表される 72 株、ペンシルバニア州立大学農学部の大腸菌リファレンスセンターから購入した 116 株、および水サンプルから分離された 151 株を含む 339 株の大腸菌株で構成されています。低・中所得国（LMIC）のさまざまな水源（川、井戸、停滞水）から収集されます。 LMIC から収集した水サンプルを 0.45 µm 膜 (Millipore HAWP04700) で濾過し、MLGA 選択培地 (Sigma # 39734) プレート上に置き、30 °C で 4 時間、続いて 37 °C で 18 時間インキュベートしました。水源ごとに最大 10 個の大腸菌コロニーを収集し、画線培養して、汚染物質の可能性があるものから分離しました。選択した株をTSB（トリピックソイブロス）中で増殖させ、-80℃で保存しました。

当社のファージコレクションは、QC ラヴァル大学から購入した 39 個のファージと、地元の水処理施設 (キング郡、天然資源・公園局、廃水) で収集された廃水サンプルから分離された 53 個のコリファージ (TH-# とラベル付け) を含む 92 個の溶解性ファージで構成されています。治療部門）前述のとおり43。簡単に説明すると、150 mL フラスコ内で生の下水 (25 mL) を 2 × LB (Luria ブロス) (25 mL) および大腸菌宿主細胞の一晩培養物 (500 μL) と混合しました。培養液の一晩のインキュベーション (37 °C、250 rpm)、遠心分離 (3000 × g、10 分間)、および濾過 (0.22 μm) の後、上清からファージライセートが得られ、その後、元の宿主株で 3 回プラーク精製されました。均一なファージストックを生成します。単離されたファージのゲノムは、他の場所で説明されているように、Illumina Miseq で完全に配列決定されました 43。ファージはコーネル大学のニューゲンコレクションに寄託されました。

私たちのコレクションからの各ファージの宿主範囲は、ECOR ライブラリー (ECOR #1 ～ #36) の 36 株からなる限定された細菌セットに対するダブルオーバーレイプラークアッセイ (LB 寒天および 0.8% ソフト LB 寒天オーバーレイ)44 によって決定されました。 ) および環境水サンプルから分離された 43 個の細菌。

制限酵素、T4 DNA リガーゼ、NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix、および NEB 5-α コンピテント大腸菌細胞は New England Biolabs, Inc. から注文しました。この研究で使用したオリゴヌクレオチドは IDT によって合成されました。化膿連鎖球菌 Cas9 (pCas9) を発現するプラスミドは、コーネル大学の Sam Nugen 氏のご厚意により寄贈されました。柔軟なリンカーを介して C 末端 CBM2a45 に連結された大腸菌のコドン最適化 NanoLuc® ルシフェラーゼ遺伝子を発現するプラスミド (pUC57-NanoLuc) と、ファージ内の特定の領域を標的とする 3 × gRNA を発現するプラスミドを、GenScript によって合成しました。ファージ配列は、NCBI からダウンロードするか、他の場所で説明されているように社内で Illumina MiSeq を使用して配列決定しました 43。配列は Geneious ソフトウェア (バージョン 11.1.5、Biomatters Ltd.、ニュージーランド、オークランド) を使用して組み立てられ 46、NCBI BLAST47、PSI-BLAST48、および Clustal Omega49 を使用して他のゲノムと比較されました。

ファージ工学は、相同組換え熟練株で以前に記載されているように、CRISPR-Cas9 システムを使用して in vivo で実行されました 50。ファージ特異的ドナープラスミドは、NEB 5-alpha での 2 段階のクローニングによって生成されました。まず、ファージ DNA をテンプレートとして使用して 600 ～ 1500 bp の左右の相同領域 (LHR および RHR) を増幅し、NEBuilder HiFi アセンブリミックスプロトコルを使用して NanoLuc-CBM カセットの上流と下流にクローン化しました。次に、機能的な crRNA リーダー配列と 3 × gRNA カセットをそれぞれのファージ特異的プラスミドにクローニングして、最終的なドナープラスミドを構築しました。使用したすべてのプライマーペアと gRNA 配列を表 S1 および表 S2 に示します。 100 ngのpCas9およびファージ特異的ドナープラスミドを、標準条件を使用してDY331中で連続的にエレクトロポレーションした。形質転換に成功した DY331 株は、他の場所で説明されているように、組換え促進ラムダレッド遺伝子について一時的に誘導されました 51。次いで、これらの菌株を、インビボ組換えのために適切なファージ（力価１０４から１０９）に感染させ、軟寒天上に注いだ。

製造業者の指示に従って調製したNano-Glo(登録商標)(Promega、ウィスコンシン州マディソン)をプレート上に均一に噴霧し、画像化して、発光する組換えファージプラークをスクリーニングした。組換えファージをＰＢＳ緩衝液（１ｍＬ）中で採取し、１０倍段階希釈物をそれぞれの宿主上に３回プレーティングして、組換えファージを精製した。すべての組換えファージは配列決定によって確認されました。 T7 の場合、レポーターファージは、T7 ファージゲノムとレポーター発現カセットの重複する PCR フラグメントのアセンブリによって構築されました。隣接する各フラグメントには 30 bp 以上の相同性があります。 T7 ゲノムの増幅に使用されるプライマー、およびレポーターカセットの挿入部位は前述のとおりです 52。組換えTH07ファージは、対立遺伝子交換基質を有する株上に野生型ファージをプレーティングし、上記のように光るプラークをスクリーニングすることによって選択した。

組換えファージは、以前の方法に従って液体培養で増殖させました53。宿主細胞(NEB 5-α)の一晩培養物を、Tween 80 (0.05%)を補充したTSB培地で希釈しました(1:100)。宿主細胞をインキュベートし（37 °C、250 rpm、OD600 = 0.15）、ファージ原液を接種し（MOI = 0.1）、さらにインキュベート（37 °C、250 rpm、3 ～ 5 時間）して高力価を生成しました。ファージ溶解物。ライセートを遠心分離（3750 × g、10 分間）して細胞残骸をペレット化し、上清を濾過（0.22 μm、EMD Millipore、バーリントン、マサチューセッツ州、米国）した後、4 °C で保存しました。ファージ溶液を精製して、増殖中に発現したNanoLucを除去した。セルロースビーズ (Avicel、PH-101、約 50 μm、Millipore Sigma、ダルムシュタット、ドイツ) をファージ溶解物に添加して (100 mL あたり 5 g、30 分、250 rpm、37 °C)、レポーターを結合させ、濾過によって除去しました。 (0.22 μm) タンジェンシャルフローろ過 (TFF) 前。部分的に精製したファージ溶解物 (50 mL) を、0.05% Tween 80 (450 mL) を含む SM 緩衝液 (50 mM Tris-HCl、8 mM 硫酸マグネシウム、100 mM 塩化ナトリウム、0.01% ゼラチン、pH 7.5) に加え、 500 kDa カットオフ膜を備えた Minimate TFF システム (Pall Biotech、ニューヨーク州ニューヨーク州、米国)。保持液の発光値が頭打ちになるまで連続ダイアフィルトレーションを行った。次に、精製したファージ溶液を元の体積まで濃縮し、膜から回収し、4 °C で保存しました。ファージ T7 の精製手順は、発光値が頭打ちになるまで連続セルロース洗浄 (100 mL あたり 5 g、滅菌濾過、5 ～ 7 回繰り返す) で構成されていました。高力価（> 109 PFU/mL）のファージストック溶液をアジ化ナトリウム（0.05％）で処理して、保存ファージストック溶液を作成しました。最後に、TSB中の8つのファージのストック溶液を混合することによってファージカクテル溶液を調製し(それぞれ最終濃度はストックから1:80)、使用するまで4℃で保存した。ファージ力価は少なくとも 6 か月間安定していました。

組換えファージの宿主範囲は、マルチウェルプレートアッセイの完全な大腸菌ライブラリー (339 株) で評価されました。一晩大腸菌培養物 (7.5 μL) を標準 96 ウェルプレート内の TSB (117.5 μL) に加え、インキュベートしました (37 °C、1.5 時間、100 rpm)。高力価（> 108 PFU/mL）の TSB 緩衝液（25 μL）中のファージ溶液を適切なウェルに添加しました（最終ウェル組成： 10 mM MgCl2、2 mM CaCl2、50 mM Tris-HCl pH 7.5 を含む TSB）。プレートをさらに 3 時間インキュベートした後、100 μL の培養物を白色の 96 ウェルプレートに移し、NanoGlo 基質と 1:1 で混合し、室温で 3 分間インキュベートした後、プレートリーダーを使用して読み取りました ( BioTek Synergy H1、読み取り高さ 1 mm、統合時間 1 秒)。

ATCC 25922 の一晩培養物を PBS で連続希釈し、Quanti-Tray/2000 システムを使用した最確数 (MPN) 技術によって測定したように、1 ～ 1000 個の大腸菌/mL を含む溶液を 3 回生成しました。各希釈液 (40 μL) を 96 ウェル PVDF フィルタープレート (Corning) の 8 つの反復ウェルに加え、濾過して細菌を収集しました。次に、TSB (90 μL) を各ウェルに添加し、プレートをインキュベートしました (37 °C、2 時間)。ファージカクテル溶液 (10 μL) を適切なウェルに添加し、プレートを 1、1.5、2、または 2.5 時間インキュベートしました。インキュベーション後、溶液を濾過し、NanoLuc レポーターを収集しました。濾液を３８４ウェルセルロースフィルター白色プレート（Ｐａｌｌ、Ａｃｒｏｐｒｅｐ）に添加し、再度濾過してニトロセルロース膜上のレポーターを収集し、濃縮した。 Nano-Glo 基質 (10 μL) を各ウェルに添加し、前述のように発光を測定しました。

細菌検出マイクロ流体デバイスは社内で設計され、製造は外部委託されました (HC 1101-001、Hochuen Medical Technology、深セン、中国)。マイクロ流体デバイスの完全な説明は、別の研究で見つけることができます22。簡単に説明すると、このデバイスは、相互に接続された 2 つの機能特徴で構成されます: (1) 環境水サンプルから細菌を分離して増殖させ、その後その場でカクテルファージ感染させるように設計された低タンパク質結合性濾過エリア、および (2) セルロースベースの収集および活性化エリアファージ誘導発光レポーター酵素について。

ケニアのナイロビの水サンプル（100 mL 以上）は、ムクル・カヤバ地域沿いのゴン川から収集され、近くの研究室に輸送されました。下水サンプル (100 mL 以上) を地元の施設から収集しました。濁度は、HTTURB® 濁度計 (Wagtech Projects Ltd.、英国サッチャム) を使用して測定し、マイクロ流体デバイスで処理するためにサンプルを 1 NTU に希釈しました。サンプルを蒸留水でさらに段階希釈して、試験用の細胞濃度範囲を生成しました。特注の濾過アセンブリを使用して、マイクロ流体チップに接続されたシリンジ上のTSB培地(10mL)に、所望の希釈液(100mL)を加えた。濾過プロセス中、出口ポートに真空が適用され、大腸菌細胞を含む 0.45 μm を超える粒子が PVDF 膜に捕捉されました。単離された細胞の代謝活性を高めるために、PVDF 膜上の蛇行チャネルチャンバーを Tween 20 (0.1%) を含む TSB 培地 (250 μL) で満たしました。次に、チップを実験室のインキュベーター内でインキュベートしました (37 °C、2 時間)。次に、培地を > 107 (250 μL) のファージカクテル溶液と交換しました。チップをさらにインキュベートして (37 °C、3 時間)、ファージ感染を可能にしました。次に、真空を適用して、生成された NanoLuc-CBM 酵素を PVDF 膜からニトロセルロース (NT) 捕捉膜に転写しました。最後に、Nano-Glo 基質 (75 μL) を NT メンブレンの下のチャンバーに加えました。光電子増倍管を備えた特注の検出アセンブリ (ET Enterprises, Ltd.、Uxbridge、UK) を使用して、発光を直ちに読み取りました22。 Aquasafe® WSL50 Pro 膜ろ過キット (Wagtech Projects Ltd.、英国サッチャム) を使用して河川サンプル内の CFU を定量し、Quanti-Tray/2000 システム (IDEXX、メイン州ウェストブルック) を使用して下水中の MPN を測定しました。サンプル。

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著者らは、Intellectual Venture の Global Good Fund I, LLC (www.globalgood.com) を通じた後援に対する Bill & Melinda Gates Foundation Trust、下水サンプルの提供に対する米国ワシントン州レントンのキング郡南水処理施設、および AgriQ に感謝します。ナイロビのクエスト研究所が研究室スペースを提供。

ルイス・F・アロンゾ、スペンサー・ギャリング、イーサン・スペンサー、アン・ロール・M・レ・ニー

現在の住所: Global Health Labs、14360 Eastgate Way、Bellevue、WA、98007、USA

パラス・ジェイン & デヴィッド・ベル

現在の住所: 細胞療法および細胞工学施設、メモリアルスローンケタリングがんセンター、ニューヨーク、ニューヨーク、10065、米国

サム・ニューゲン

現在の住所: 独立コンサルタント、イサクア、ワシントン州、98027、米国

Intellectual Ventures Laboratory、14360 SE Eastgate Way、ベルビュー、ワシントン州、98007、米国

ルイス・F・アロンゾ、パラス・ジェイン、トロイ・ヒンクリー、ニック・クルート＝ライニグ、スペンサー・ギャリング、イーサン・スペンサー、ヴァン・TT・ディン、デヴィッド・ベル、ケビン・P・ニコルズ、アン・ロール・M・レ・ニー

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LFA と A.-LLN は、PJ、NC-R.、SG、TH の支援を受けて原稿を執筆しました。 PJ と TH は組換えファージを作成しました。 NC-R。ファージ宿主範囲実験を実施した。 SG と TH は ES の助けを借りてファージを維持し、精製しました。 ES は下水サンプルを入手しました。 LFA はマイクロ流体チップで実験を実施しました。 VD、DB、SN がプロジェクトの計画に貢献しました。 A.-LLN は KN とともにプロジェクトを監督しました。著者全員が批判的なフィードバックを提供し、研究の形成を支援し、原稿をレビューしました。

Anne-Laure M. Le Ny への往復書簡

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

アロンゾ、LF、ジェイン、P.、ヒンクリー、T. 他ファージベースのアッセイを使用して、汚染水サンプル中の大腸菌を迅速、高感度、低コストで検出します。 Sci Rep 12、7741 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-11468-2

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受信日: 2021 年 12 月 13 日

受理日: 2022 年 4 月 18 日

公開日: 2022 年 5 月 11 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-11468-2

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