南シナ海の冷湧水からのメタゲノム配列と 768 の微生物ゲノム

Scientific Data volume 9、記事番号: 480 (2022) この記事を引用

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冷湧出微生物群集は地球上の魅力的な生態系であり、深海の異なる環境における生存戦略を理解するための独自のモデルを提供します。この研究では、南シナ海のサイトF冷湧水田で収集されたサンプルから23のメタゲノムが生成されました。これには、無脊椎動物群集のすぐ上にある海水、冷湧水の流体、無脊椎動物群集の下の流体、周囲の堆積物柱が含まれます。浸出ベント。ビニングツールを使用して、完成度が 60% 以上であると推定される合計 768 個のメタゲノム構築ゲノム (MAG) を取得しました。 MAG のうち、61 個は 90% 以上完了していると推定され、さらに 105 個は 80% 以上完了していると推定されました。系統ゲノム解析により、597 個の細菌 MAG と 171 古細菌 MAG が明らかになり、そのほぼすべてが既知の培養分離株と遠縁でした。 768 MAG では、門レベルで豊富な細菌にはプロテオバクテリア、デスルホバクテリウム、バクテロイドタ、パテシバクテリア、クロロフレクソタが含まれ、一方、豊富な古細菌にはアスガルダルキオータ、サーモプラズマトータ、およびサーモプロテオータが含まれていました。これらの結果は、深海の微生物生態をさらに調べるために利用できるデータセットを提供します。

測定

メタゲノム組み立てられたゲノム

テクノロジーの種類

メタゲノム配列決定とゲノムビニング

サンプルの特徴 - 生物

微生物

サンプル特性 - 環境

海洋冷湧出バイオーム

サンプルの特徴 - 場所

南シナ海

冷湧出物は、堆積地下からのメタンに富んだ流体の移動が海底に現れたもので、燃料となる化学合成相互作用を介して独特のコミュニティを支えています1。冷湧水に生息する微生物は、メタンの化学エネルギーを生成物に変換し、ガス漏れ周囲の豊かな底生生物群集を維持します2。次世代シーケンス手法の使用により、浸出微生物叢に関する洞察が大幅に向上し、微生物生態学が多様性微生物分布パターンから深海環境における適応生存戦略へと進歩するでしょう。

サイト F (フォルモサ海嶺としても知られる) の冷湧水は、南シナ海 (SCS)3 の北東斜面にある活発な冷湧水の 1 つであり、天然ガスハイドレートが海底に露出し、化学合成物質で覆われています。主に深海貝とガラセイドカニからなる群落4．地球化学的特徴は、開発されたラマン挿入プローブ (RiP) システムと統合センサーを使用した現場検出によって示されています 5、6、7。メタン濃度の水平方向と垂直方向の変動は、繁栄しているコミュニティの中心から堆積物の縁までの領域で対照的な傾向を示しました6。冷湧出液では CH4 または H2S ラマンピークは検出されませんでしたが、緑豊かな化学合成コミュニティの下の流体では溶解した CH4 が確認され、冷湧出付近で収集された堆積物間隙水プロファイルは、SO42- の損失と CH4 の増加によって特徴づけられました。、H2S および HS- ピーク 5、7。深海の冷湧水の微生物群集は、浸出溶液中の地球化学的成分によって形成されることが多いため、私たちは 2017 年にサイト F の冷湧出地からサンプルを収集しました。これには、無脊椎動物群集のすぐ上にある海水、冷湧出液、無脊椎動物群集の下の流体と湧出口周囲の堆積物柱（図 1 および表 1）。メタゲノムは Illumina HiSeq X Ten プラットフォームで配列決定され、各メタゲノムから約 52.7 Gbps ～ 80.6 Gbps のクリーンな塩基が得られました (表 2)。さらに、完全性が60％を超え、汚染が20％未満であると推定される環境細菌および古細菌の768個のメタゲノム構築ゲノム（MAG）を取得しました（補足表1）。 MAG のうち、61 個は 90% 以上完了していると推定され、さらに 105 個は 80% 以上完了していると推定されました。高品質の MAG (完全性 > 90%、汚染 < 5%) が 59 個あり、全体の 7.68% を占めました。嫌気性メタン栄養性古細菌（ANME）、好気性メタン栄養性細菌メチロコッカス目、硫酸塩還元デスルホバクテラル目、硫化物酸化性カンピロバクテラル目およびチオトリカレス目（補足表2）は、基質供給の観点からメタン湧出所での最も好ましい微生物代謝とよく一致します。一方、系統ゲノム解析では、このドラフトゲノムセットには、古細菌のバティアーキオータ (30)、エニグマルキオータ (29)、ヘイムダラルキオータ (20)、パケアルキオータ (10) や細菌のパテシバクテリア ( 44)、WOR-3 (23)、Zixibacteria (13)、Marinisomatota (12)、およびEisenbacteria (6) et al. (図2)。さらに、NPL-UPA2 (7)、UBP15 (4)、FCPU426 (2)、SM23–31 (2) などを含む、いくつかの新しい門の可能性もあります。ここで説明するすべての非重複ドラフトメタゲノム組み立てゲノムは、国立バイオテクノロジー情報センター (NCBI) に寄託されました。これらのデータは、世界的に重要な系統群内の大規模な比較ゲノム解析の参考として機能する下流解析のリソースを提供するとともに、新規微生物代謝の探索を可能にすることが期待されます。

サンプル収集とデータ分析プロセス。 (a) 南シナ海北部の冷湧水田の位置とサンプリングエリア。 (b) この研究で実行されたサンプリングとメタゲノム分析の概略図。各四角形は、対応する分析で使用される説明 (太字)、方法、またはツールを含むプロセスを象徴しています。

南シナ海の冷湧水からの 768 個のメタゲノム構築ゲノム (MAG) の系統学的多様性 (補足表 2)、および RefSeq で利用可能な細菌および古細菌の参照ゲノム (補足表 3)。スケールバーは、アミノ酸位置ごとに 3.00 個の置換に対応します。各ノードのドラフトゲノムの数が提供されます。赤い点のある枝には培養された代表者がいません。

サンプルは、2017 年 9 月の巡航中に KEXUE 研究船によって南南CS北部の冷湧水田から回収されました（図 1a および表 1）。無脊椎動物群集のすぐ上の水は、潜水 164 および 165 中に、FAXIAN 遠隔操作車両 (ROV) に装備された現場採水シリンダーによって収集されました (それぞれサンプル ID: SW_1 および SW_2)。冷浸出流体は潜水 166 中にガスプルームで収集され (サンプル ID: SW_3)、無脊椎動物群集の下の流体は潜水 167 中に収集されました (サンプル ID: SW_4)。各サンプルの約 15 L の水を 0.22 μm ポリカーボネート膜 (Millipore、ベッドフォード、マサチューセッツ州、米国) を通して濾過しました。メンブレンは -80 °C で保存され、DNA 抽出に使用されました。堆積物コアは、潜水 157 中に無脊椎動物群集近くの還元性堆積物エリアで ROV によって収集されました。プッシュコアの薄い外層 (< 1 cm) は、汚染を避けるために廃棄されました。長さ 20 cm の黒色還元堆積物コアをプッシュコア装置を用いて 2 cm ごとに層状にスライスしました（サンプル ID: RS_1 ～ RS_10）。別の堆積物コアは、深海の軽量で監視および制御可能なロングコアリングシステム8によって同じ場所で収集され、海底下0〜300 cm（cmbsf）のサンプル層が堆積物コアから収集され、35層にスライスされました。 cm サブサンプル (サンプル ID: RS_11 ～ RS_19)。すべてのサブサンプルは、DNA 抽出まで -80 °C で保存されました。環境データ（CH4、H2S、SO42-）は、以前のレポートでROVに搭載された深海レーザーラマン分光計によってその場で検出されました5、9。

この研究におけるワークフローの概略図を図 1b に示します。 PowerSoil DNA Isolation Kit (QIAGEN) を使用して、2.5 g の各堆積物サブサンプルからゲノム DNA を抽出しました。 PowerWater DNA Isolation Kit (QIAGEN) を使用して、0.22μm フィルターからのゲノム DNA を抽出しました。 DNA をゲル電気泳動で検査し、Qubit® 2.0 Flurometer (Life Technologies, CA, USA) の Qubit® dsDNA Assay Kit を使用して DNA 濃度を測定しました。 OD 値は 1.8 ～ 2.0 で、ライブラリの構築には 0.4 μg 以上の DNA 含有量が使用されます (表 2)。

メタゲノム配列決定は、Novogene (中国、天津) で、Illumina HiSeq X Ten プラットフォーム上の Illumina 2 × 150 PE プロトコルを使用して実行されました。 Readfq v8 (https://github.com/cjfields/readfq) を使用してシーケンスプラットフォームから取得した生データを前処理し、その後の分析に使用するクリーンデータを取得しました。 23 サンプルすべてのクリーンデータは、NCBI Genbank (SRA) でアクセッション番号 SRR13892585 ～ SRR13892607 (表 2) および BioProject アクセッション番号 PRJNA707313 で入手できます。

最初の de novo アセンブリは、MEGAHIT v1.1.3 をデフォルトのパラメータで使用して実行されました10。その後の分析に偏りをもたらす可能性がある短いゲノムアセンブリ (< 1,000 bp) は、最初に除外されました。次に、MetaWRAP v1.2.1 パイプライン (デフォルトパラメーター) によって実装された MetaBAT 2、MaxBin 2.0、CONCOCT などのさまざまなビニングツールを使用して、テトラヌクレオチド頻度、ディファレンシャルカバレッジ、GC コンテンツ、コドン使用量に基づいてゲノムをビニングしました (補足表) 1)11、12、13。ビニング結果は MetaWRAP パッケージ (パラメーター: -c 60 -x 20)14 を使用して洗練され、生成されたすべてのビンセットは dRep v2.3.2 (パラメーター: -comp 60) を使用して 95% の平均ヌクレオチド同一性 (ANI) で集約および複製解除されました。 -コン20 -サ0.9）15．各ビンの分類学的分類は、CheckM v1.0.3 およびデフォルトパラメーターを使用した GTDB-Tk によって決定されました (補足表 2)16、17。次に、さまざまなビナーのビン品質評価 (完全性 > 60%、汚染度 < 20%) が CheckM v1.0.3 (パラメーター: lineage_wf) によって実行されました17。次に、各サンプルに対して選択されたビンが、MetaWRAP パイプラインを通じて実装された metaSPAdes を使用して再組み立てされました 14,18。最終的な MAG のコーディング領域は、Prodigal v2.6.3 (メタゲノムモード -p メタ) を使用して予測されました 19。予測されたすべての遺伝子は、ダイヤモンド blastp (パラメーター: -e 1e-5 – id 40) を使用して、nr データベースと KEGG 原核生物データベースに対して検索されました 20,21。すべての MAG のデータは、アクセッション番号 JAGLBO000000000 ～ JAGMFB000000000 で NCBI Assembly で入手できます (補足表 1)。

NCBI GenBank からアクセスした 768 のドラフトゲノムと 208 の参照ゲノム配列 (補足表 3) を組み合わせて、Orthofinder (デフォルトのパラメーター) による系統解析用のオルソログを見つけました。各オルソログは、MUSCLE v.3.8.31 (パラメーター: -maxiters 16)23 を使用してアライメントされ、trimAL v.1.2rev59 (パラメーター: -automated1)24 を使用してトリミングされ、手動で評価されました。各オルソログの遺伝子ツリーは、FastTree v2.1.9 (パラメーター: -gamma -lg;) を使用して構築されました25。最終的な種ツリーは、STAG v1.0.0 (https://github.com/davidemms/STAG) を使用して 40,080 の遺伝子ツリーに基づいて推定され、FigTree v1.4.3 (http://tree.bio.ed. ac.uk/software/figtree/) (図 2)。

このプロジェクトは、BioProject アクセッション番号 2 で DDBJ/ENA/GenBank に寄託されています。 PRJNA707313、シーケンスリードアーカイブがアクセッション SRR13892585~SRR1389260726,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44 の下で寄託されています、45、46、47、48。すべての 768 MAG のコンティグを含む fasta ファイル (系統樹の newick 形式) を含むその他のデータは、figshare49 を通じて入手できます。

サンプルの潜在的な汚染は、微生物叢群集の分析に関するガイドラインに従うことによって制限されました50,51。簡単に説明すると、サンプルは研究船 KEXUE の研究室にある滅菌ステーションで前処理されました。 DNA 抽出は、層流フード下の専用実験室スペース内で、無菌技術 (表面滅菌、DNA-OFF、滅菌プラスチック製品の使用、エアロゾルバリアピペットチップの使用など) を使用して行われました。すべての堆積物サンプルには同じバッチの PowerSoil DNA 分離キットを使用し、すべての浄水器サンプルには PowerWater DNA 分離キットを使用して、サンプル処理は 2 日以内に完了しました。フィルタリングおよびトリミングされた Illumina リードは、デフォルトのパラメータを備えた fastp v0.20.1 (https://github.com/OpenGene/fastp) を使用してシーケンス品質について評価されました52。すべてのサンプルにおいて、各サンプルのリードの Q スコアが計算され、90% 以上のリードが Q30 のスコアを獲得したことが示され (表 2)、ほとんどのリードが低いエラー率で構築されていることを示しています。メタゲノムデータは、原稿に記載されている自動化された品質管理手順とアセンブリ手順を使用して、MAG に組み立てられ、洗練されています。コンティグのアセンブリ品質を保証するために、MEGAHIT のアセンブリ手順ではいくつかの kmer (21,29,39,59,79,99,119,141) が選択されました。ビニングに関しては、より厳格な基準が選択され、最良の結果を保証するためにビニング後のシーケンスが再組み立てされました。

上記のメソッドは、関連セクション内の分析に使用されるプログラムを示しています。個々のデータパッケージの分析に使用されるコードは、https://github.com/zhcosa/MAGs-from-cold-seep に保管されています。

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我々は、中国科学院 (CAS) の国家主要科学技術インフラの調査船 KEXUE と海洋メガサイエンスのキャンター (CAS) の支援に感謝します。特にFAXIAN ROVのパイロットと乗組員に感謝します。また、技術的なアドバイスや有益な議論をしてくださった研究室メンバー全員に感謝します。この研究は、山東省海洋科学技術基金パイロット国立海洋科学技術研究所 (青島) (2022QNLM030004-3)、中国国立自然科学財団 (42030407 および 42076091)、および RV のシニアユーザープロジェクトから資金提供を受けました。 KEXUE (KEXUE2021GH01 および KEXUE2019GZ06)。

Huan Zhang 氏、Minxiao Wang 氏も同様に貢献しました。

深海研究センターおよび海洋生態環境科学の CAS 主要研究所、中国科学院海洋研究所、青島、266071、中国

Huan Zhang、Minxiao Wang、Hao Wang、Hao Chen、Lei Cao、Zhaoshan Zhong、Chao Lian、Li Zhou、Chaolun Li

海洋メガサイエンスセンター、中国科学院、青島、266071、中国

Huan Zhang、Minxiao Wang、Hao Wang、Hao Chen、Lei Cao、Zhaoshan Zhong、Chao Lian、Li Zhou、Chaolun Li

中国科学院大学、北京、100049、中国

チャオルン・リー

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MW、HZ、CL が研究を設計しました。 MW、HZ、HC、LC、CL、ZZ がサンプルを収集しました。 MW、HZ、HC、HW、LZ が分析を実行しました。 HZ と MW は論文を書き、図と表を作成しました。共著者全員が最終原稿についてコメントしました。

Chaolun Li への通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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Zhang, H.、Wang, M.、Wang, H. 他。南シナ海の冷湧水からのメタゲノム配列と 768 の微生物ゲノム。 Sci Data 9, 480 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41597-022-01586-x

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受信日: 2022 年 4 月 14 日

受理日: 2022 年 7 月 21 日

公開日: 2022 年 8 月 6 日

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