膜結合に必要な C 型肝炎ウイルス E2 の領域 | 南寧ピーコックプライド株式会社

Nature Communications volume 14、記事番号: 433 (2023) この記事を引用

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C 型肝炎ウイルス (HCV) はハイブリッド侵入メカニズムを使用します。現在の構造データは、低 pH および分化クラスター 81 (CD81) に曝露すると、エンベロープ糖タンパク質 E2 のアミノ末端が規則正しくなり、2 つの不変芳香族残基を含む内部ループを宿主膜に放出することを示唆しています。今回我々は、曲がった構造の膜結合ループと隔離された芳香族側鎖を備えた、アミノ末端が短縮された E2 の構造を提示します。以前に報告された同じ Fab を持つ 3 つの E2 構造との比較は、この内部ループが柔軟であり、局所的な状況が疎水性残基の露出に影響を与えることを示しています。生化学的アッセイにより、アミノ末端が切断された E2 には、E2 細胞外ドメインのベースラインの膜結合能力が欠如していることが示されています。したがって、アミノ末端領域は、CD81 と膜の相互作用の両方にとって重要な決定因子です。これらの結果は、HCV 侵入メカニズムについての新たな洞察を提供します。

Hepatitis C virus (HCV) is a leading cause of chronic hepatitis, cirrhosis, and hepatocellular carcinoma with significant morbidity and mortality rates in humans1. The World Health Organization estimates that there are 1.5 million new HCV infections each year and 58 million people worldwide are chronically infected (2021)." href="/articles/s41467-023-36183-y#ref-CR2" id="ref-link-section-d85794354e485">2. In the United States, annual acute HCV infections increased by 387% from 2010 to 2019 in association with rising addiction to intravenously administered opioids (2019)." href="/articles/s41467-023-36183-y#ref-CR3" id="ref-link-section-d85794354e489"> 3. 最近承認された直接作用型抗ウイルス薬は、HCV4 のすべての遺伝子型に対して非常に効果的ですが、一度治癒すると再感染する可能性があります。依存症や薬物の静脈内使用に関しては、HCV 感染からの持続的な保護がまだ満たされていない医療ニーズです。

分化クラスター 81 (CD81)5、スカベンジャー受容体クラス B タイプ I (SR-BI)6、クローディン 1 (CLDN)7、およびオクルディン (OCLN)8 は、HCV の侵入に必要な細胞因子です。 HCV の CD81 への結合をブロックすることが、抗体媒介中和の主な手段です9。 CD81 はさまざまな細胞株で遍在的に発現しており、肝細胞特異的受容体結合に二次的な役割があることが示唆されています 10,11。 CD81 は、4 つの膜貫通ヘリックスと 2 つの細胞外ループ (それぞれ SEL および LEL) として示される内在性膜タンパク質です。低 pH 処理では HCV12 は不活化されません。 CD81-LEL と低 pH の両方とインキュベートすると、HCV に構造変化が生じ、ウイルスが許容細胞に侵入する能力が不可逆的に減少します 13。低 pH 緩衝液または CD81-LEL による前処理は HCV 感染力を増加させ、これらの条件のそれぞれが必要なプライミングステップであることを示しています 13。

HCV エンベロープ糖タンパク質 1 および 2 (E1 および E2) は受容体の結合と侵入を媒介しますが、E2 は CD81 および SR-BI5,6 と特異的に相互作用します。 E2は、アミノ（N）末端の可溶性糖タンパク質とカルボキシ（C）末端の膜貫通ヘリックス（TM）を持つI型膜タンパク質です（図1a）。番号付けは、ここで研究した J6 配列 (遺伝子型 2a) に基づいており、遺伝子型によってわずかに異なることに注意してください。中央の E2core は球状の折りたたまれたドメインで、N 末端の超可変領域 1 (HVR1)、抗原部位 (AS) 412、前層、HVR2 とステム領域に隣接するジスルフィド安定化免疫グロブリンサンドイッチを含みます。 C末端14（図1a）。 E2core (残基 460 ～ 646) の全体的な構造には、中央の免疫グロブリン β サンドイッチ内部シート (残基 485 ～ 519) に続いて、CD81 結合ループ (残基 520 ～ 539) および短い β サンドイッチシート (残基 540) が含まれます。 –570）。 E2core は外部ドメインの E2 アーキテクチャ全体を保持していますが、CD8115 に結合することはできません。

a 完全長 E2 (分離株 J6、遺伝子型 2a)、および構造および機能の研究に使用されるさまざまなフラグメントの概略図。 b E2コア+ステムのX線結晶構造(PDB ID: 8DK6)。最終モデルは、E2core+stem の残基 491 ～ 571 および 596 ～ 653 で構成されます (c) E2core 構造 (PDB ID: 4WEB) は、残基 488 ～ 522、538 ～ 571、および 596 ～ 649 で構成されます。 d eE2 構造 (PDB ID: 7MWW) は残基 422 ～ 453、490 ～ 571、および 596 ～ 650 で構成され、e ΔHVR1 eE2/tCD81-LEL (PDB ID: 7MWX) は残基 418 ～ 453、490 ～ 571、および 597 ～ 650。各構造 (b ～ e) は、非中和 2A12 Fab 抗体の存在下で決定されました (図示せず)。 2A12 Fab 重鎖および軽鎖残基は、それぞれ残基 1 ～ 219 および 1 ～ 218 で構成されます。 CD81 結合ループ (520 ～ 539) 領域は、E2core+stem、E2core、eE2、ΔHVR1 eE2/tCD81-LEL、およびフロント層に従って、それぞれ赤、シアン、青、緑、小麦色に色分けされています。 CD81 結合ループの先端にある Tyr529、Trp531 残基、および前層の Ile422 も強調表示されます。無秩序な領域は破線で表されます。 b ～ e の E2 の方向はほぼ同じです。最終的な構造モデルで構築された各鎖の残基番号が与えられます。

最近、低 pH で非生産的な宿主タマリン CD81-LEL (tCD81-LEL) の存在下および非存在下での E2 の構造が報告されました 16。 CD81 が存在しない場合、E2 の細胞外ドメイン (eE2) には、前層の Ile422 に挟まれた内部ループ (CD81 結合ループ) があります。低 pH で CD81 に結合すると、eE2 は 2 つの構造変化を受けます。前層は AS412 を CD81 の周りに折り畳むことによって CD81 と相互作用し、CD81 結合ループはコアから伸びます。 CD81 結合ループは、ループの先端に 2 つの不変の疎水性残基 (Tyr529 および Trp531) を示し、これらは宿主膜との相互作用に重要です 16。

ここでは、CD81-LEL と膜結合における前層とステムの役割を特徴付けます。サイズ排除クロマトグラフィーおよびリポソーム浮選アッセイにより、E2 前層が CD81-LEL と膜相互作用の両方にとって重要な領域であることが実証されました。非中和抗体2A12の存在下で、HVR1、AS412、前層、およびTM領域を欠くE2コア+ステムのX線結晶構造（図1a）を決定しました。この構造では、ステム領域は無秩序ですが、CD81 結合ループは曲がった立体配座にあり、ループの中心内に Tyr529 残基と Trp531 残基が隔離されています。 CD81 結合ループの拡張は、これまで考えられていたよりも微妙なところがあり、その柔軟性がウイルスの侵入と融合において重要な役割を果たしている可能性があります。

X 線結晶構造解析によって決定された以前のすべての HCV E2 構造では、タンパク質の溶解性と結晶形成の安定性を高めるために、ステム (646 ～ 712) および TM アンカー (713 ～ 746) 領域が省略されていました 15、16、17、18、19、20。ステム領域の構造的役割を理解するために、2A12 Fab の存在下および非存在下でさまざまな E2 フラグメントに対して結晶化試験を実行しました。 2A12 Fab に結合した E2core+stem (456-713) フラグメントの結晶を、約 2.5 Å の分解能で測定しました (表 1)。最終モデルは、E2core+stem の残基 491 ～ 571 および 596 ～ 653、ならびに 2A12 Fab の重鎖残基 1 ～ 219 および軽鎖残基 1 ～ 218 で構成されます。 E2core+stem構造とE2core、eE2、およびΔHVR1 eE2/tCD81-LEL複合体とのアラインメントにより、同様の炭素アルファ位置に対してそれぞれ0.49Å、0.46Å、および0.80Åの二乗平均平方根偏差（RMSD）が得られました。 (図1)15,16． E2core+stem 構造では、ほとんどのステム領域 (残基 653 ～ 713) について解釈可能な密度がありませんでした。最近の E1E2 構造では、ステム領域が E1 と複合体を形成しており、この領域の折り畳みが E1 に依存している可能性があることが示唆されています 21。 E2コア+ステム構造は、CD81結合ループ（残基520〜539）の連続電子密度を示しています（補足図2）。これは、以前に報告された構造（図1）とは異なり、結晶パッキングによって安定化されています（図2）。。

a E2core+stem/2A12 Fab 複合体の非対称ユニットが示されています。 b E2core + ステム/2A12 Fab 複合体の結晶パッキングは、ページ内への 2 つの回転軸の周りの対称合致を強調表示します (黒い楕円)。 CD81 結合ループ (赤色) は対称メイトに対して詰め込まれており、ループを曲がった立体構造に保持しています。 HCおよびLCは、それぞれ2A12 Fabの重鎖および軽鎖を指します。

E2コア+ステム構造は、結晶化シャペロン2A12 Fab15,16に結合したHCV分離株J6からのE2フラグメントの4番目の構造を表します(図1)。その結果、tCD81-LELの存在下または非存在下で同じ遺伝子型からの異なるE2長の構造を比較すると、重要なメカニズムの詳細が明らかになります。 4 つの E2 構造間の主な構造の違いは、CD81 結合ループの方向です (図 1b-e)。重ね合わせ計算から CD81 結合ループを削除すると、同様の炭素アルファ原子の RMSD は 0.3 Å 未満に低下しました。したがって、前層、HVR1、およびステムの存在は、E2 コア領域の球状ひだに影響を与えません。 E2コア+ステム構造のCD81結合ループは、E2の後層に向かって曲がっています（図1bおよび3a）。

a 曲がった (E2 コア + ステム、PDB ID: 8DK6)、b 収縮した (eE2) (PDB ID: 7MWW)、および c 3 つの異なる方向に伸びた (ΔHVR1 eE2) (PDB ID: 7MWX)。明確にするために、Y529、W531、および I422 が強調表示され、c 結合 tCD81-LEL は示されていません。

CD81 結合ループの移動の程度をよりよく理解するために、ループを他の E2 構造の対応する領域と比較しました。 HVR1、AS412、および E2core 構造の前層 (PDB ID 4WEB) を欠失させると、CD81 結合ループが障害されました (図 1c)。 CD81のないeE2構造では、前層、特に残基Ile422がCD81結合ループを収縮位置に配向します（図1dおよび3b）。低pHおよびtCD81-LELの存在下では、ΔHVR1 eE2のAS412領域は秩序化され、残基Ile422は約9Å移動し、拡張されたCD81結合ループと一致します（図1eおよび3c）。 CD81-LEL の非存在下 (収縮) の E2core+stem (曲がった) と前層を含む eE2 の CD81 結合ループ残基 Tyr529 または Trp531 間の距離は、それぞれ約 17 Å と約 19 Å です (図.4a)。 tCD81-LELとの複合体からのΔHVR1 eE2の伸長CD81結合ループと、曲がったE2core +ステムとを比較すると、Tyr529とTrp531のそれぞれ〜30Åと〜22Åの距離の移動が実証されました（図4b）。さらに、ループの向きは CD81 とは反対方向に曲がっています。参考のために、tCD81-LELの非存在下および存在下でのCD81結合ループの動きを示します（図4c）。

a E2core+stem の曲がった CD81 結合ループ (赤) と eE2 の収縮した CD81 結合ループ (青)、b ΔHVR1 eE2 の伸長した CD81 結合ループ (緑) と ΔHVR1 eE2 の曲がった CD81 結合ループの重ね合わせE2コア+ステム(赤)、およびc ΔHVR1 eE2の伸長したCD81結合ループ(緑)およびeE2の収縮したCD81結合ループ(青)。 b、c ΔHVR1 eE2 (緑色) に結合した tCD81-LEL は示されていません。隣接する骨格残基は灰色です。 Y529 および W531 側鎖の位置はヘテロ原子スティックとして示され、距離が示されています。

CD81結合ループは、構造決定に使用された4つの構築物のそれぞれに存在していましたが、AS412/前層およびステム領域の変化と同時に異なる立体構造を採用したため、これらの違いがCD81結合を調節しているという仮説を立てました。 E2core 単独ではヒト CD81-LEL (hCD81-LEL) に結合できませんが、eE2 は tCD81-LEL15 と比較して低い親和性で hCD81-LEL に結合します。したがって、我々は、E2 ステム領域が hCD81-LEL 結合に影響を与える可能性があるかどうかを調べました。 E2core + ステムをヒト hCD81-LEL と低 pH でインキュベートし、その後サイズ排除クロマトグラフィー (SEC) によって分析しました。 hCD81-LELに対するE2親和性は低pH16の存在下で増加するため、低pH緩衝液を使用しました。 E2コアへのステムの追加は、2A12 Fabの存在下または非存在下でhCD81-LELに結合できませんでした（補足図1）。これらの結果は、最近の eE2/tCD81-LEL 構造と一致して、前層が CD81-LEL 相互作用の重要な決定因子であることを特定しました 16。

HCV eE2 は、酸性化と CD81 相互作用の両方によって増加するベースラインの膜結合を示し、Ile422、Tyr529、または Trp53113,16 の変異によって除去されます。 2 つのモデルのいずれも、膜挿入のための E2 の N 末端領域と CD81 結合ループの間の相互作用を説明できます (図 5)。 CD81 結合ループの伸長が膜結合に必要かつ十分な場合、調節性の N 末端領域を削除すると CD81 結合ループが解放され、その結果、CD81 の非存在下でも膜に効率的に結合する E2 タンパク質が得られます。あるいは、N 末端領域が膜挿入を促進する方法で CD81 結合ループの提示を補助している場合、N 末端領域を欠失させると、膜に結合できない E2 タンパク質が生成されます。リポソーム浮選アッセイを使用して、膜結合に対する E2 の前層とステムの影響を評価しました。簡単に説明すると、eE2、eE2 + ステム (図 1a)、または E2core + ステムを、pH 5.0 の tCD81-LEL の存在下または非存在下でリポソームとインキュベートし、ショ糖勾配で分離し、E2core 特異的分子を用いたウェスタンブロットによって検出しました。抗体（図6、補足図3）。タマリン CD81 は HCV 感染をサポートし、より高い親和性で E2 に結合するため、tCD81-LEL を浮選アッセイに使用しました 16、22、23。遊離タンパク質はショ糖勾配の底部に残りますが、リポソーム結合タンパク質は勾配の上部に移動します。 eE2 は、tCD81-LEL の存在下で低 pH で劇的なリポソーム結合を示しますが、ステム領域 (eE2+stem) の追加では、tCD81-LEL の追加によりシグナルがより穏やかに増加します。これは、膜会合を阻害する E1 の非存在下でステム領域 (60 残基) が乱れているためである可能性があります。逆に、E2core + ステムは、tCD81-LEL の存在に関係なく、低 pH では膜結合および浮遊を示せませんでした。 HVR1の有無にかかわらず、eE2に対して行われたリポソーム浮選は、tCD81-LELの非存在下および存在下において、低pHでリポソームへの同等の結合を示した。したがって、HVR1は、E2が膜と相互作用する能力にほとんど影響を与えません（補足図4）。リポソーム浮選アッセイの結果（図６および補足図４）は、膜会合のためのＣＤ８１結合ループの組織化において前層が重要な役割を果たしていることを強調している。 eE2の浮遊は、前層のIle422（CD81結合ループの収縮型でTyr529に隣接する）のアラニン置換が膜会合で失敗するという以前の発見と一致している16。 E2core+stem構造では、CD81結合ループは反対方向に曲がり、Tyr529とTrp531がループ内に隔離されています（補足図2）。要約すると、E2 の前層、CD81 受容体、および低 pH はすべて、膜結合のための CD81 結合ループを適切に提示するために不可欠な要件です。

a 全長のヒト CD81 構造 (膜貫通ヘリックスが黄色に着色されたリボン図) と配位コレステロール分子 (薄緑色のヘテロ原子スティック) (PDB ID: 5TCX) が、理想的なパルミトイルオレオイルホスファチジルコリン (POPC) 膜二重層にドッキングされました 44。灰色の球の平行面は膜二重層の疎水性コアを定義するカルボニル部分を表し、代表的なリン脂質は二重層にドッキングされており、シアン色のヘテロ原子スティックとして示されています。 CD81-LEL (空色) のリボン図、伸長 (ΔHVR1 eE2) および屈曲 (E2 コア + ステム) 構造の CD81 結合ループをそれぞれ緑と赤で示します。 b パネルは、CD81 結合ループと膜の一部の拡大図であり、疎水性膜コアからの Tyr529 および Trp531 の相対距離 (点線) が標識されていることを示しています。

a リポソーム浮選アッセイからの上部、中間、下部画分のウェスタンブロット。タンパク質分子量マーカーおよび eE2 ローディングコントロールマーカーは、それぞれ L および M としてマークされます。浮選アッセイは 3 つの独立した実験で行われ、そのうちの 1 つのアッセイが示されています。各実験では同じ傾向が示されました。つまり、低 pH では tCD81-LEL の有無にかかわらず E2core+stem の浮遊は見られませんが、eE2 については tCD81-LEL の存在下でシグナルが顕著に増加し、eE2+stem では増強が減少しました。ゲルソースデータについては、補足図 3 を参照してください。 b 任意の単位を使用したトップフラクションのウェスタンブロットの定量。

ここで我々は、CD81結合と膜結合のためのCD81結合ループの調節に必要なHCV E2の領域を記載し、HCV侵入に関するユニークな機構的洞察をもたらした。 E2 の CD81 結合ループは膜結合に関与していますが、このループは膜結合には必要ですが不十分です。非結合型で CD81 結合ループに隣接する N 末端領域も膜結合に必要です。 AS412 および前層を含むこの N 末端領域は、Ile422 を介して膜結合に影響を与える抗体媒介中和の主要部位である CD81 結合部位を形成します。したがって、このメカニズムは単なる部品の合計ではなく、細かく調整されていると推測されます。

ここでは、2.5 Åの分解能で決定された非中和Fab 2A12に結合したE2コア+ステムフラグメントの構造を示します。 E2core+stem、E2core、eE2、およびΔHVR1 eE2/tCD81-LEL複合体の構造は、感染の初期段階における独特の機構に関する洞察を示し、受容体結合およびエンドソームの酸性化中に起こる変化のモデルをもたらします（図6）。 E2core 領域には、折りたたまれた球状ドメインが含まれています。 AS412 とフロント層は、CD81 結合ループと CD81 相互作用の適切な位置決めにとって重要な決定因子です。 CD81 が存在しない場合、前層の Ile422 は CD81 結合ループを収縮位置に保持します。 E2core と E2core+stem はどちらも in vitro で hCD81 に結合できず、受容体結合における N 末端領域 (384-459) の重要性を示しています。 HCV は、鳥肉腫白血病ウイルス (ASLV) と同様に、膜付着のハイブリッド方法を使用します。これには、細胞受容体と低い pH24 が必要です。これらの条件下で、E2は2つの構造変化を受けます。前層がCD81と相互作用し、AS412領域をCD81の周りに折り畳み、内部ループ（CD81結合ループ）がコアから離れる方向に伸びます（図7a）。 CD81 結合ループの先端にある 2 つの不変の疎水性残基 (Tyr529 および Trp531) が宿主に向かって伸長し、膜に挿入されます。 E2フロント層を削除すると、CD81相互作用が消失し、CD81結合ループが解放されます（図7b）。しかし、E2コア+ステムは膜に結合できず、CD81結合ループだけでは膜結合に不十分であり、適切な配向には前層が必要であることを示唆しています（図6）。合計すると、これら 4 つの構造は、CD81 結合ループの柔軟性、N 末端領域の調節機能の機構的全体像、およびウイルス侵入プロセスの詳細な理解を提供します。

a CD81 が存在し、pH が低い場合、前層が CD81 を包み込み、次に CD81 結合ループが宿主膜に向かって伸びます。 b E2の前層が欠失すると、CD81結合ループが解放され、低pHでもCD81に結合できなくなり、膜と相互作用する能力が失われます。

すべてのエンベロープウイルスは細胞膜と相互作用して融合し、ウイルスゲノムを細胞内に送達します。 E2/tCD81-LEL 複合体を CD81 の全長構造上にモデル化する (PDB ID: 5TCX25) Tyr529 と Trp531 は、二重層に向かって伸びる CD81 結合ループの先端に位置しています (図 5)。これらの残基はすべての主要な遺伝子型によって不変であり、CD81 結合とウイルス侵入に必要です 26,27。 E2コア+ステム構造をeE2/全長CD81複合体に重ね合わせると、Tyr529とTrp531が膜の外側リーフレットから、理想的なホスファチジルカルボニル層からそれぞれ35Åと31Å以上離れた位置に配置されます（図5）。）。 E2 の N 末端領域は、CD81 結合ループを膜に向けて配向するのに役立つ可能性があります。図 5 のモデルは、理想的な二重層を使用しています。ただし、CD81結合ループの柔軟性は、エンドソーム内の宿主膜の湾曲や他の因子（すなわち、E1、OCLN、および/またはCLDN）の存在により、膜挿入のためにループの柔軟性が必要となる可能性があるHCV感染中に有利である可能性があります。。

ウイルス膜融合タンパク質は、融合を引き起こす 4 つの機構を備えた構造基準に基づいて 3 つのクラス (I、II、III) に分類されます 24。現在、HCV 融合タンパク質は分類はおろか、最終的に同定されていません。 HCV E1 糖タンパク質は、推定上の融合ペプチドを含むため、E1E2 ヘテロ二量体の融合サブユニットであると提案されています 28,29。しかし、E2 の CD81 結合ループには膜結合特性があり、E2 には II 型融合タンパク質と同様の IgG 様ベータサンドイッチフォールドが含まれています 24,30。さらに複雑な分類では、ウイルスと宿主の効率的な融合には E1 と E2 が必要であり、どのクラスにも属さない機能です。おそらく、CD81 結合ループは標的膜に埋め込まれ、融合プロセスを助けます。すべての融合誘導性ウイルスタンパク質は三量体ですが、TM ヘリックスまたは E1 がオリゴマー化に影響を与える可能性があるにもかかわらず、E2 三量体の証拠は見つかっていません。 3 つの中和 Fab と複合体を形成した E1E2 糖タンパク質の cryoEM 構造が最近発表されました 21。これには、E1E2 ヘテロ二量体の単一コピーが含まれています。同様に、ステムを含めても eE2+ ステム構造に三量体は生成しませんでしたが、これは E2 タンパク質のカルボキシル末端で相互作用する 2A12 Fab によるものである可能性があります。 HCV 融合プロセスについての洞察を得るには、さらなる研究が必要です。

SR-BI および CD81 は、感受性細胞への最初の付着後に E2 と直接相互作用することが示されています。 SR-BI は N 末端 HVR1 を介して結合しますが、CD81 は AS412、AS432、CD81 結合ループ、背面層を含む不連続領域を介して E2 タンパク質に結合します 6,16。しかし、SR-BI と E2 の相互作用の分子機構は不明のままです。低 pH トリガーを持つ CD81 は、構造変化を誘導するのに十分である可能性があります。 SR-BI は、HCV 分離株に依存した方法で構造変化を誘導するのに効果的である可能性があります 31,32。

融合に二次受容体である CD81 を使用することはウイルスにとって有利であり、これまでの観察と一致しています 13。 E2とCD81-LELは中性pHで複合体を形成し、細胞表面でもそうする可能性がありますが、エンドソームの酸性化と一致して、複合体の安定性と均一性は低pHで増加します。 tCD81-LEL は D ヘリックスが解けた開いた立体構造をとりますが、ヒト CD81 は閉じた立体構造で観察されることが最も多く、中間および開いた立体構造も記載されています 33。 E2/tCD81-LEL 構造は、酸性化後、融合による構造変化前の複合体のスナップショットにすぎません。他のウイルス融合タンパク質の説明と同様に、HCV の融合機構を適切に説明するには追加の構造的および機構的研究が必要です。

E2 の HVR には、かなりの割合の HCV 配列変異体が含まれています。これらの領域は、中和抗体回避の 1 つのモードです。患者では、抗体による抗原ドリフトにより HVR1 が急速に変化します。広範な中和抗体は、CD81 結合部位と競合する HCV E2 の保存された立体構造エピトープに対して向けられます。 CD81 結合ループは表面に露出しており、構造難読化によって抗体媒介の中和から保護されています。膜挿入における CD81 結合ループの同定は、HCV ワクチン設計のターゲットを提供します。異なる HCV 遺伝子型間での CD81 結合ループ配列の保存性が比較的高いこと、および HIV34、エボラ出血熱 35、36、37、インフルエンザ 38、デング熱 39 を含む他のウイルスの膜結合ループがワクチンおよび中和抗体の主要な標的であるという観察は、CD81 結合ループ配列がワクチンおよび中和抗体の主要な標的であることを示唆しています。 HCV の結合ループは潜在的な治療標的となる可能性があります。これらの原子結晶構造から得られる情報は、予防的 HCV ワクチンの設計の開発に役立つ可能性があります。

HCV 分離株 J6 E2 フラグメント (E2core + ステム残基 456 ～ 713、eE2 + ステム残基 384 ～ 713、および eE2 残基 384 ～ 656) および CD81-LEL (ヒトおよびタマリンの残基 112 ～ 202) を HEK293T GnTI( –) 細胞 (ATCC、CRL-3022) を使用し、前述のように精製しました40。簡単に言うと、レンチウイルスベクターは、CMVプロモーター、プロラクチンシグナル配列、上記のJ6 E2フラグメント、HRV3C切断部位、それに続くC末端プロテインAおよびFlagタグを含んでいます。安定して発現する HEK293T GnTI(-) 細胞は、レンチウイルス形質導入によって生成されました。次に、長期増殖とタンパク質生産のために、細胞を付着細胞バイオリアクター (Cesco Bioengineering) で増殖させました。上清培地を 2 日ごとに収集し、IgG アフィニティークロマトグラフィーとその後の HRV3C プロテアーゼインカラム消化によって精製しました。このタンパク質を、GSTおよびQカラムを用いたサブトラクティブクロマトグラフィー、続いてSuperdex200カラム(Cytiva Life Sciences)を用いたサイズ排除クロマトグラフィーによって高品質に精製した。各タンパク質の最終収量は上清あたり約 5 ～ 10 mg でした。

このプロトコールは以前の研究16から適応されました。簡単に言うと、マウス 2A12 ハイブリドーマ細胞株を CELLine Classic バイオリアクターフラスコ (Sigma-Aldrich) で増殖させました。 15% 低 IgG FBS および 10 mM HEPES pH 7.5 (培地) を含むイスコフ改変ダルベッコ培地 (IMDM) 中の 6 × 106 細胞 6 mL をフラスコの内層に接種しました。上部膜に、1％低IgG FBSおよび10 mM HEPES pH 7.5（栄養培地）を含む350 mLのIMDMを補充した。細胞コンフルエンシーが 6 × 108 に達したら、培地を収集し、1000 rpm で 20 分間遠心分離しました。上清 2A12 培地をプロテイン G カラムを通してさらに精製しました。パパイン消化して2A12 Fabを生成する前に、精製した2A12抗体を20 mMリン酸ナトリウムpH 7.0および10 mM EDTA中で透析し、システイン-HClを最終濃度20 mMまで添加し、pHを7.0に調整した。約 100 μL の固定化寒天ビーズパパイン (Thermo Fisher Scientific) を 20 mg の 2A12 抗体に使用し、穏やかに反転させて 22 °C で一晩インキュベートすることにより 100% 消化を達成しました。 4200 × g、4 °C で 20 分間遠心分離して固定化パパインを除去することにより、消化反応を停止しました。精製された 2A12 Fab は、プロテイン A カラムとプロテイン G カラムによる 2 段階の精製を通じて達成されました。２０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．５、２５０ｍＭＮａＣｌ、および５％グリセロールを精製に使用し、プロテインＧカラムについては、結合した２Ａ１２Ｆａｂを０．０５％ＴＦＡによって溶出し、これを１ＭＴｒｉｓｐＨ８．０によって直ちに中和した。 2A12 Fab は、さらなる使用および長期保存のために、20 mM Tris pH 8.0 で脱塩されました。

E2core+stem (残基 456 ～ 713) を 2A12 Fab で 1:1.2 (w/w) で再構成し、それに hCD81-LEL を 1:1.3 のモル比で添加しました。複合体を 4 °C で一晩インキュベートしました。複合体を、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ４．５、１００ｍＭＮａＣｌ緩衝液中で、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＣｙｔｉｖａＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）サイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。主要なピーク (補足図 1) を収集し、3 kDa MW カットオフの Amicon 超遠心濾過ユニット (Millipore) を通して最終濃度 5 mg/mL まで濃縮しました。サイズ排除クロマトグラフィーのピークの分析は、hCD81-LELが複合体に結合しないことを示しています（補足図1B）。 E2core+stem/2A12 Fab 複合体は、さまざまな結晶化スクリーン (Hampton Research) を備えた蚊液処理システム (SPT Labtech) を使用して、小規模、400nL、液滴サイズでセットアップされました。回折品質の結晶は、Hampton HR2-139 スクリーン、条件 D10 で成長しました。 0.2 M クエン酸ナトリウム三塩基性二水和物、20% w/v PEG 3350、pH 8.3。凍結保護剤として 30% エチレングリコールを使用して、96 ウェルプレートから結晶を直接凍結し、液体窒素中で瞬間冷却しました。データは、アルゴンヌ国立研究所の APS にある SER-CAT 22-ID ビームラインで 0.979 Å で収集されました。

E2core+stem (残基 456 ～ 713) -2A12Fab 結晶は、単位胞パラメータ a = 48.97 Å、b = 125.54 Å、および c = 157.32 Å を持つ空間群 P22121 に属します。分子位相は、開始モデルとして PDB エントリ 7MWW を使用して、PHENIX_phaser41 によって決定されました。 Fab 重鎖と軽鎖を明確に配置することで、Coot42 によるモデル構築と密度変更の反復ラウンドを使用して、eE2 座標をカバーするようにマップを拡張するために必要な段階が提供されました。反復改良サイクルごとに、さまざまな品質パラメータに関してモデルが評価されました。最終モデルは 2.45 Å の解像度で構築されました。 E2core+stem モデルには残基 491 ～ 571、596 ～ 653、および 2 つの N-アセチルグルコサミンが含まれていますが、残基 456 ～ 490、572 ～ 595、および 653 ～ 713 は柔軟性のため欠落しています。 2A12 Fab モデルは、それぞれ軽鎖と重鎖の残基 1 ～ 218 と 1 ～ 219 で構成されます。モデルは Rwork 0.203 および Rfree 0.231 に改良され、MolProbity ソフトウェア 43 を使用して計算されたラマチャンドランプロットの優先領域の残基の 96.12%、許容値の 3.53%、および外れ値の領域 0.35% が含まれます。処理されたデータ全体の CC1/2 (ピアソン相関係数) は 0.991 で、外殻の CC1/2 は 0.571 です。データの全体的な完全性は 97.8% で、冗長性 4 と 4.2 の外側シェルではそれぞれ 99.1% です。データ処理とリファインメントの統計を表 1 に示します。

リポソーム浮選アッセイはわずかに変更を加えて適応されました 16。 15 μg の J6 E2 フラグメント [eE2core+stem (残基 456 ～ 713)、eE2 (残基 384 ～ 656)、eE2+stem (残基 384 ～ 713)、または ΔHVR1 eE2 (406 ～ 656)] を 18 μｇのＣＤ８１－ＬＥＬ（ＣＤ８１－ＬＥＬの６倍モル過剰）、および２０ｍＭのクエン酸ナトリウムｐＨ５．０および１００ｍＭのＮａＣｌで容量を６０μＬに調整した。サンプルを氷上 4 °C で一晩インキュベートしました。 Encapsula NanoSciences の 200 nm 大豆 PC: コレステロールリポソーム (70:30 モル比) (ストック 10 mM または 8 μg/μL) (CPC-610) 54 μL を加え、軽くたたきながら 37 °C で 1 時間インキュベートしました。一定の間隔で。インキュベーション後、タンパク質と脂質間の非特異的な静電結合を最小限に抑えるために、67 μL の 3 M KCl を最終濃度 1 M KCl まで添加し、37 °C で 15 分間インキュベートしました。次いで、２０ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ５．０および１００ｍＭＮａＣｌ緩衝液中の６７％（ｗ／ｖ）スクロースを、最終体積５００μＬ中最終濃度４０％まで添加した。サンプルを 1 mL ピペットで穏やかに混合し、オープントップ薄壁超透明遠心管 (Beckman Coulter、344060) 内で 0.1 mL 5% および 11.4 mL の 25% (w/v) スクロースの段階勾配下に置きました。）。グラジエントを SW40 Ti スイングバケットローター (Beckman Coulter Optima XL-100K 超遠心機) を使用して 4 °C、281,000 × g で 150 分間遠心分離しました。遠心分離後、各勾配を上から下に、600 μL の 20 個の画分に分画しました。次に、上部または中間の画分を、10 kDa MW カットオフの Amicon Ultra-0.5 mL 遠心フィルターユニット (Millipore) で 10,000 × g の速度で最終容量 150 μL まで濃縮しました。ウェスタンブロット分析のために、15 μL 10× SDS-PAGE 還元色素をこれらのサンプルのそれぞれに添加しました。

すべての画分を 10 × SDS-PAGE 還元サンプルバッファーで最終濃度 1 × まで希釈し、95 °C で 5 分間変性しました。各サンプル 50 μL を eE2 マーカーおよび Odyssey タンパク質分子量マーカー (Li-Cor) (L) とともに 4 ～ 20% Bis-Tris プレキャストゲル (Bio-Rad) 上で泳動しました。次に、Trans-Blot Turbo Transfer System (Bio-Rad) を使用してタンパク質を PVDF 膜に転写しました。メンブレンを Intercept (PBS) Blocking Buffer (Li-Cor) で 37 °C で 1 時間ブロックし、続いてブロットを精製 8A6 マウスの 1:500 希釈液と 4 °C で一晩インキュベートしました。一次抗体希釈液は、0.05% Tween 20 (Sigma-Aldrich) を含む PBS 中の Odyssey Blocking Buffer で調製しました。二次抗体である IRDye 800CW ヤギ抗マウス IgG (Li-Cor、926-32210) を 1:10,000 希釈で使用しました。ウェスタンブロットは、Li-Cor Odyssey ソフトウェア (v.3.0) を使用してスキャンされました。

モノクローナル抗体 8A6 は、Arash Grakoui 博士 (IACUC プロトコール番号 YER-2002369-070816GN、エモリー大学医学部、米国ジョージア州アトランタ) の研究室で生成されました。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、完全フロイントアジュバント（初回免疫のみ）または不完全フロイントアジュバント中の５０μｇのｅＥ２を隔週で８週間腹腔内に免疫した。脾細胞の収集の4日前に、50μgのeE2による最終免疫を静脈内に与えた。ハイブリドーマは、融合パートナーとしてクローン化された HAT 感受性マウス骨髄腫細胞株を使用して生成されました。増殖中のハイブリドーマを、ELISA を介して eE2 に結合する能力についてスクリーニングし、その時点で 8A6 が明確に同定されました。

ハイブリドーマ細胞を、10％低IgG FCS（Hyclone）およびゲンタマイシン（Gibco）を含むIMDM（Hyclone）中で増殖させた。上清を収集し、4000 × g、4 °C で 10 分間遠心分離して清澄化しました。モノクローナル抗体は、プロテイン G アフィニティーカラムクロマトグラフィーによって精製し、Amicon Ultra-15 遠心分離フィルターユニット (Millipore) を使用して濃縮しました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究を裏付けるデータは、合理的な要求に応じて対応著者から入手できます。この研究で生成された座標および構造因子は、アクセッションコード 8DK6 (E2 コア + ステム/2A12 Fab) でタンパク質データバンク (PDB) に寄託されています。この研究で使用された以前に公開された構造は、アクセッションコード 4WEB (E2 コア)、7MWW (eE2 構造)、7MWX (ΔHVR1 eE2/tCD81-LEL)、および 5TCX (CD81 全長) で見つけることができます。

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優れた技術支援をしていただいた M. Paskel 氏に感謝いたします。この作業は、国立アレルギー感染症研究所（JM）およびNIHを助成する国立研究所の学内研究プログラムによってサポートされていました。R01AI136533、R01AI124680、R01AI126890、およびU19AI159819がAGおよびORIP/P5132（P5165）に賛成センター（AG）。先進光子源の使用は、契約番号 W-31-109-Eng-38 (SER-CAT) に基づいて、米国エネルギー省科学局基礎エネルギー科学局によって支援されました。

国立衛生研究所 (NIH) によって提供されるオープンアクセス資金。

これらの著者は同様に貢献しました: Ashish Kumar、Tiana C. Rohe。

国立衛生研究所、国立アレルギー感染症研究所、感染症研究所、構造ウイルスセクション、ベセスダ、メリーランド州、20892、米国

アシシュ・クマール、ティアナ・C・ローエ、アルタイラ・D・ディアボーン、ジョゼフ・マルコトリジャーノ

エモリー国立霊長類研究センター、微生物学および免疫学部門、エモリー大学医学部、エモリーワクチンセンター、アトランタ、ジョージア州、30329、米国

エリザベス・J・エルロッド & アラシュ・グラクイ

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アブドゥル・G・カーン

研究技術部門、国立アレルギー感染症研究所、国立衛生研究所、ハミルトン、モンタナ州、59840、米国

ライアン・キッシンジャー

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AGK は E2 + ステム構築物と発現細胞株を生産しました。 AK と TCR はタンパク質を精製し、結晶化条件を決定しました。 AK と JM は、X 線結晶構造解析データの結果を収集、処理、分析しました。 AK と ADD は、膜浮選データを設計、実行、分析しました。 EJEとAGは8A6抗体を生産した。 RKがデザイン・製作したモデルです。著者全員が原稿の執筆と編集に協力してくれました。

ジョセフ・マルコトリジャーノへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Kumar、A.、Rohe、TC、Elrod、EJ 他。膜結合に必要な C 型肝炎ウイルス E2 の領域。 Nat Commun 14、433 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41467-023-36183-y

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受信日: 2022 年 8 月 8 日

受理日: 2023 年 1 月 19 日

公開日: 2023 年 1 月 26 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36183-y

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