塩の確立

Communications Biology volume 5、記事番号: 1352 (2022) この記事を引用

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メトリクスの詳細

産業廃水の排出、農業生産、海運、石油採掘、その他の活動は、マイクロプラスチック、石油とその製品、重金属、農薬、その他の有機物を含む深刻な海洋汚染を引き起こしています。 海洋汚染のバイオレメディエーションの効率は、高い塩濃度（>1%、w/v）によって制限される可能性があり、微生物の活動が明らかに失われる可能性があります。 この研究では、塩ストレスを打ち消す機能的プロモーター P1、P2-1、および P2-2 が Vibrio natriegens Vmax 株から単離および同定されました。 海洋株 Vmax を使用して、ポリエチレン テレフタレート (PET)、クロルピリホス (CP)、およびヘキサブロモシクロドデカン (HBCD) を分解する 3 つの塩誘起分解モデルを構築しました。 操作された株は、対応する基質の分解に効率的であり、分解速度はそれぞれ、15 mg/L PET で 8 日間、50 mg/L CP で 24 時間、1 mg/L HBCD で 4 時間です。 さらに、キチン結合タンパク質 GbpA を発現させることにより、遺伝子操作された菌株をリサイクルおよび再利用するための固定化戦略が実現されました。 この研究は、海洋汚染を効率的に分解するための、V. natriegens Vmax などの急速に増殖する海洋細菌の使用への答えを得るのに役立つ可能性があります。

工業や農業の急速な進歩に伴い、深刻な海洋環境汚染は、特に開発途上国において経済社会発展にとって顕著な問題となっている1。 重金属、石油、残留性有機汚染物質 (POP)、瓦礫、放射性核種などの海洋汚染は、生物や資源に直接的または間接的に有害となる可能性があります2。 プラスチック汚染は過去 50 年間で激化し、海洋に含まれるプラスチックの推定量は 250,000 トンを超えています3。 海洋緑藻表面のマイクロプラスチック粒子の吸着、膜技術によるマイクロプラスチックのろ過、さらにはメンブレンバイオリアクターとの組み合わせなど、吸着とろ過によるマイクロプラスチックの除去が構築されており、その除去効率は97.2%に達しています4。 マングローブの堆積物から分離された 2 種類のバチルス株は、異なるマイクロプラスチックを分解し、その減少量は 0.0019 mg/日のみであることが判明しました5。

しかし、海水中のマイクロプラスチックの分解についてはほとんど研究されておらず、塩分濃度が 3.3 ～ 3.7% の海洋条件下で汚染物質を分解できる細菌は限られています。

耐塩性細菌は、適合溶質（水溶性の糖または糖アルコール、他のアルコール、アミノ酸、またはそれらの誘導体）、エクトイン、トレハロース、グリシンベタインなどのさまざまな有機浸透圧溶質（OOS）を高濃度に蓄積することができます6 、7、8、9、10。 これらの OOS は、細胞質と外部環境の浸透圧バランスを維持し、細胞の正常な生物学的活性を維持するのに役立つ可能性があります。 多くの海洋生物は軽度の好塩性（海水中に 3% w/v NaCl を含む）です。

海洋環境から分離された V. natriegens Vmax 株の世代時間は 10 分未満で、最適濃度 2 ～ 3% (w/v) の NaCl なしでは増殖できません 11。 IPTGまたはアラビノース誘導性プロモーター（それぞれlacUV5およびaraBAD）の制御下にあるT7 RNAポリメラーゼ遺伝子を含むカセットを、V. natriegens（ATCC 14048、V. natriegens Vmaxの元の株）の大きな染色体に挿入しました。 T7 プロモーターの制御下にある GFP 遺伝子を含む発現プラスミドを導入すると、強力な GFP 発現が検出されました 12。 しかし、特に海洋環境における環境汚染物質の分解の宿主として V. natriegens を使用することに関する報告はほとんどありません。

この研究では、Vmax 株を塩ストレス下で環境汚染物質を分解するために使用しました。 まず、Vmax 株の耐塩性機構がトランスクリプトーム解析によって提案され、関連する塩誘導性プロモーターが同定および特徴付けされました。 次に、同定されたプロモーターに基づいて、クロルピリホス (CP)、ヘキサブロモシクロドデカン (HBCD)、およびポリエチレン テレフタレート (PET) を分解する 3 つのモデルが構築されました。 操作された菌株に使用されるリサイクルは、ビブリオ種に特有で海洋環境に豊富に存在するキチン物質に菌株を結合させることによって制御された。

塩 (NaCl または Na+) によって誘導される構成的発現要素を見つけるために、処理グループ (5% (w/v) NaCl で培養した Vmax 株) と対照グループ (1% NaCl で培養した Vmax 株) を比較するトランスクリプトーム解析を行いました。実行されました。 トランスクリプトーム分析用のサンプルは指数関数期で採取され、Log2 の倍数変化を伴う遺伝子転写レベルがヒート マップにクラスター化されました (図 1a)。 合計 1596 個の遺伝子が同定され、そのうち 728 個の遺伝子が上方制御され、868 個の遺伝子が下方制御されました。 上方制御された遺伝子は、GO 分析によって 25 のカテゴリーに分類でき (図 1b)、最も制御されている触媒活性が含まれます。 次に、KEGG代謝経路に関与する上方制御された遺伝子は6つの分岐に分割され、そのうちABCトランスポーター（ko02010）および2成分系（ko02020）に関連する遺伝子が最初に豊富な遺伝子でした（図1c）。

a 2 つのグループ (5 および 1%) の各遺伝子の log2 (5%/1%) を使用した階層分析に基づくヒート マップは、1,596 個の遺伝子が検出されたことを示しました。 色は青から赤の範囲であり、log2 (5%/1%) の値を表します。 b Log2 ≧ 4 の倍率変化を持つ遺伝子の GO カテゴリーが大幅に濃縮されました。 c Log2 ≧ 4 の倍率変化を持つ遺伝子の異なる遺伝子 KEGG 経路分類。 d トランスクリプトーム解析に基づいた Vmax 株の好塩性機構の提案。

塩ストレスに関連する潜在的な要素を特定するために、4 倍を超えて上方制御される遺伝子が選択されました (補足表 3)。 塩ストレスに関連する 3 つの遺伝子クラスター。エクトイン生合成遺伝子クラスター ectBACD (8.96、9.47、および 8.52 倍上方制御)、プロリン/グリシンベタイン ABC トランスポーター proWXV (9.02、8.86、および 8.79 倍上方制御) を含みます。 )、ベタイン生合成遺伝子 BCCT (6.20、6.09 倍アップレギュレーション)、およびフラジェリン集合に関するクラスター (7.16、5.59、5.43、4.38、4.24、および 4.07 倍アップレギュレーション) が含まれていました。 52 個の遺伝子が上方制御されています13。 Na+/H+ 対向輸送体は通常、細胞内浸透圧を維持するためにナトリウムイオンを輸送することによって機能し、その編集遺伝子 NhaC は 4.49 倍上方制御されました。 トランスクリプトーム解析の結果に基づいて、Vmax 株の耐塩性機構には、エクトインまたはプロリン/グリシンベタインなどの適合溶質の分泌と、合成またはチャネルに対応する遺伝子の転写レベルの上方制御を介した Na+ の輸送の強化が含まれると提案します。 (図1d)。

塩ストレスによって誘導されるプロモーターは、特定の環境における微生物の生存にとって重要な要素です。 塩によって誘導される潜在的なプロモーター要素を同定するために、最も上方制御される遺伝子/遺伝子クラスターの前部 400 bp 配列が候補として選択されました。 上方制御された遺伝子のほとんどはゲノム全体にランダムに分布しており、2 つの上方制御された遺伝子クラスター ectBACD と proWXV は反対方向に分布していました。 興味深いことに、2 つのクラスター間の 717 塩基対間隔の領域が特定され、2 つの方向を持つ 3 つのプロモーターを含むことが予測されました (図 2a)。 プロモーター P1 (AAACACTTTATAAAGTCCCTTAACTTCCAGTATGGGGTCCATGTAATCGT) の転写方向は遺伝子クラスター proWXV と一致し、プロモーター P2 (P2-1: TTCAGAAGCTGTTAATAGCGCGGGGGATCGTAAATTAGAAAATA ATATAT; P2-2: TAAGGGACTTTATAAAGTGTTTGGTGAGAACCCAGAGCGT GCTTTCTCAC) の転写方向は同じでした。クラスターの場合は ectBACD。

a 3 つの提案されたプロモーターを備えた 2 つの上方制御された遺伝子クラスターの概略図。 (色は応答遺伝子の上方制御を表します。配列はプロモーターの提案された領域を示し、拡大された文字は転写の開始部位を示します)。 b 提案されたプロモーターの同定と特性評価のフローチャート。 c 単位セル内の mRFP/eGFP の蛍光強度の検出。 P1 (400 bp 遺伝子配列フロント クラスター proWXV)、P2-1 (逆方向 400 bp 配列フロント遺伝子クラスター ectBACD)、または P2-2 (逆方向 400 bp 配列フロント クラスター proWXV)、および全長インターバル領域 (P12、およびその逆の配列は P21) でした。 エラーバーは平均値の標準誤差です。

プロモーター P1、P2-1、および P2-2 を含む領域は、pS8K-mRFP にライゲーションすることによってさらに特徴付けられました。 赤色蛍光タンパク質（mRFP）の非常に目に見える発現が検出され、強化された緑色蛍光タンパク質（eGFP）遺伝子を使用して同時二方向活性化が測定されました（図2b）。 3% Na+ ストレス下では、プロモーターのみを含む切断領域 P1 (400 bp 遺伝子配列フロント クラスター proWXV)、P2-1 (逆方向 400 bp 配列フロント遺伝子クラスター ectBACD)、P2-2 (逆方向 400 bp 配列フロント クラスター) proWXV）、または全長区間領域（P12、およびその逆配列はP21）は転写活性を持っています（図2c）。 mRFP 遺伝子の転写がプロモーター P2-2 で開始されると、最も強い蛍光が検出されました。

同定されたプロモーターの分解能力を試験および検証するために、3 つの分解モデルを構築し、特徴付けました。 CP分解に関連する主な機能遺伝子は、プロモーターP1およびP2-1の制御下で構築され（図3a、b）、Vmax-mpdp12tcpXAが得られました。 ここで、初期濃度 100 mg/L の CP の約 50% は 8 時間で分解できます。 さらに、シトクロムモノオキシゲナーゼ（CYP168A1）、4Fe-4Sフェレドキシン（Fd）、および緑膿菌HS9由来のNAD（P）H依存性フェレドキシンレダクターゼ（FNR）を含む触媒酵素系を構築しました（図3c）。 、Vmax-cyp168A1p12FdFNR株が得られます。 HBCD（1 mg/L）は、8時間以内にペンタブロモシクロドデカノール（PBCDOH）やテトラブロモシクロドデカジオール（TBCDDOH）などの脱臭素化生成物に完全に変換できました（図3d）。

クロルピリホス (CP) 分解の研究基盤と塩誘導性 CP 分解のプラスミド図。 b 農薬 CP の代謝効率の検証。 c ヘキサブロモシクロドデカン（HBCD）分解の研究基盤と塩誘発性HBCD分解のプラスミド図。 d HBCD の代謝効率の検証。

転写効率を高めるために、プロモーター領域を P1 から P2-2 に短縮した 3 番目のモデルを構築しました。 PETase または LCC は PET を触媒して主生成物としてモノ-(2-ヒドロキシエチル) テレフタル酸 (MHET) およびビス-(2-ヒドロキシエチル) テレフタル酸 (BHET) を生成することができるため、MHETase または Tfca は BHET および MHET をさらに触媒してエチレンを生成することができます。グリコール (EG)、テレフタル酸 (TPA)、およびその他の成分を温和な条件下で除去します (図 4a)。 ここでは、塩誘導性 PET 分解株を構築するために、最も高い触媒活性を持つ 4 つの改変された PET 加水分解酵素が選択されました。 PET の分解は、ヒドロキシル化生成物 BHET および MHET の生成によって確認されました。 全細胞と粗細胞の両方が PET を分解する可能性があり、分解効率は異なりました (図 4b、c)。 細胞全体の場合、4 つの操作されたコンストラクトの分解速度は、Vmax-MHETaseP122PETase (MPP) > Vmax-PETaseP122MHETase (PPM) > Vmax-TfcaP122LCC (TPL) > Vmax-LCCP122Tfca (LPT) としてランク付けされました。 生成物BHETおよびMHETは、MPP構築物中で8日後に10 mg/Lおよび11 mg/Lで最大蓄積して検出されました（図4b）。 PPMコンストラクトの粗酵素では、BHETとMHETは最初の24時間でそれぞれ5.0と40 mg/Lに蓄積し、48時間で0に減少しました（図4c）。 MPP 構築物の粗酵素では、BHET と MHET は最初の 24 時間と 60 時間でそれぞれ 127 mg/L と 14 mg/L まで蓄積しました。 LPT 構築物の粗酵素では、BHET および MHET は最初の 24 時間で 105 mg/L および 48 mg/L まで蓄積しました。 TPL 構築物の粗酵素では、BHET は 120 時間で 128 mg/L まで蓄積しましたが、MHET は 24 時間までに 76.5 mg/L まで蓄積し、その後 120 時間で 11 mg/L まで減少しました。 酵素に適した温度のため、粗酵素の活性は細胞全体の活性よりも強かった。 PPM、MPP、LPT、およびTPL株で処理したPET膜サンプルの表面形態の変化を図4dに示します。 未処理の PET と比較して、処理済みサンプルではさまざまな程度の断片化が検出されました。 PET 膜の分解については、MPP サンプルで最も明白な変化が観察され、これは分解生成物の蓄積と一致していました。

a この研究におけるポリエチレン テレフタレート (PET) 分解のための PET 加水分解酵素の組み合わせ: PETase + MHETase または LCC + Tfca。 b 4 つの操作された PET 株の全細胞分解システムにおける生成物モノ-(2-ヒドロキシエチル) テレフタル酸 (MHET) およびビス-(2-ヒドロキシエチル) テレフタル酸 (BHET) の蓄積。 構築されたプラスミドのマップは灰色で描画されます。 c 4 つの操作された PET 分解株の粗酵素系における生成物 MHET および BHET の蓄積。 d 原子間力顕微鏡（AFM）（NANOCUTE II、セイコーインスツルメンツ株式会社）によって検証されたPET膜サンプルの表面形態の変化。

環境バイオレメディエーションにおける遺伝子操作株のより適切な適用を達成するには、環境および生態学的安全のために遺伝子操作株の漏洩を防止することが不可欠です。 コレラ菌のキチン結合タンパク質 GbpA を pMD18T ベクター内の操作された Vmax 株 (Vmax-cyp168A1p12FdFNR) に追加し、Vmax-GbpA-cyp168A1p12FdFNR (VgHBCD) をもたらしました。 この改変株では、タンパク質GbpAの分子量と一致する53 kDaのタンパク質が発現およびSDS-PAGEで検出され、VgHBCDのキチンへの接着が約2倍増強されました（図5a、b）。 走査型電子顕微鏡（SEM）でキチン表面のバイオフィルムを観察することができました（図5c）。 VgHBCD が付着したキチン材料を NSS 緩衝液で洗浄して回復の可能性をテストしたところ、細菌バイオフィルムの約 80% がキチンの表面に保持されました。 さらに、キチンに結合した場合の VgHBCD の HBCD 分解能力が各洗浄後に検出されました。

a SDS-PAGEによるキチン結合タンパク質GbpAの発現の分析。 M、タンパク質マーカー。 レーン1～3、粗酵素、上清、Vmax株の沈殿。 レーン 4 ～ 6、Vmax-GbpA 株の粗酵素、上清、沈殿。 b 3-(4,5)-ジメチルチアヒアゾ (-z-y1)-3,5-ジフェニルテトラゾリウムロミド (MTT) アッセイキットによるキチンへのバイオマス結合の測定。 エラーバーは平均値の標準誤差です。 c 加速電圧20 kVの走査電子顕微鏡（SEM）S3400II（日立、日本）によるバイオアンカーキチンの形態。 d – f HBCD、CP、mPETそれぞれに対するキチン固定株の回収率と分解効果の検証。

HBCDの分解率は、最初のターンでは50％、第2および第3ターンでは100％でした（図5d）。 キチンに結合する組換え株 VgCP は、100 mg/L クロルピリホスを 3 回のリサイクルすべてで完全に分解できました (図 5e)。 キチンに結合する VgPPM、VgMPP、VgLPT、および VgTPL 株は mPET を分解する可能性があり、蓄積された生成物 BHET および MHET が HPLC によって検出されました。 最初のターンでは、積 BHET と MHET が大幅に蓄積しましたが、第 2 ターンと第 3 ターンではさらにわずかに蓄積しました (図 5f)。

産業活動により、有機物で汚染された環境は頻繁に塩分および超塩分ストレスにさらされます。 塩濃度が高いと (>1%、w/v)、微生物の活動が失われ、酵素活性が制限される可能性があります。 これらの問題を克服する戦略には、細菌を高塩分濃度に適応させたり、耐塩性の高い微生物を使用したりすることが含まれます。 V. natriegens の塩応答機構に関する情報は限られており、有機汚染物質を分解するプラットフォームとしての有用性も含まれています。

さまざまな好塩性および耐塩性微生物の塩応答メカニズムは広範囲に研究されており、そのメカニズムには、細胞質内の無機イオン Na+/K+ を選択的に輸送して、エクトイン、プロリン、ベタイン、トレハロースなどの低分子量の特定の有機物質を蓄積させることが含まれます。 、コリン-O-硫酸、カルニチン。 生合成の転写制御に関する情報は、圧倒的にエクトインの生合成に関するものです14。 報告されている耐塩性細菌のほとんどは、メチロツビミクロビウム アルカリフィラム 20Z (NC_016112.1)15、バチルス ハロデュランス C-125 (BA000004.3)16、ストレプトミセス コエリカラー A3 (AL645882.2 など) など、塩ストレスに適応するために適合性のある小分子を分泌できます。 )17、ハロモナス エロンガタ HEK1 (FN869568.2)18、およびクロモハロバクテリウム サレキシゲンス DSM 3043 (CP000285.1)19。 上記の細菌のゲノムに位置するエクトイン生合成遺伝子 (ectABC クラスター) は、ectAp1、PectA、PectA、PectA1-4 などの ectA の「ATG」コドンに隣接する塩誘導性プロモーターの制御下で転写されます。 PectB、PectA1-4、および PectB。 V. natriegens では、ectABC 遺伝子クラスターは、3 つのプロモーターの制御下で、反対方向にグリシンベタイン / プロリン輸送系遺伝子に隣接していました（補足図 1）。 Vmax 株における塩ストレスに関連する遺伝子の位置は、報告されている他の好塩性または耐塩性微生物と比較して、明らかに位置特異的な利点を示します。 Na+/K+転写とエクトイン、プロリン、ベタイン生合成に関連する遺伝子をほぼ同時に発現誘導することができた。 その結果、他の好塩性および耐塩性細菌と比較して、V. natriegens におけるエクトイン合成およびベタイン/プロリン輸送のための 2 つの遺伝子クラスター間の距離が短くなったことで、感受性プロモーターと同様に、浸透圧バランスを維持する能力が向上したことがわかりました。

塩害環境におけるバイオレメディエーションの必要性を考えると、塩ストレス下での特殊な細菌の増殖・分解能力を高めることは有意義である。 したがって、塩ストレスのある有機物に汚染された環境におけるバイオレメディエーションの実際の適用について、同定されたプロモーターの可能性を評価することが最も重要です。 ここでは、3 つの劣化モデルを構築しました。 クロルピリホス (CP) は、最も広く使用されている有機リン (OP) 殺虫剤の 1 つであり、神経行動学的損傷を引き起こします。 Vmax-mpdp12tcpXA の分解速度 (24 時間で 50 mg/L) は、天然分解細菌 Stenotrophomonas sp. の分解速度よりもはるかに低かった。 YC-1、18 時間で 100 mg/L CP を分解する可能性があります。 おそらく、P1 の制御下にある遺伝子の発現は、最初の生成物である 3,5,6-トリクロロ-2-ピリジノール (TCP) を代謝するには十分ではなかったと考えられます 20,21。 2 番目のモデルでは、建材、エレクトロニクス、繊維、プラスチックに添加される臭素化難燃剤 (BFR) の中で 2 番目に一般的に使用されているヘキサブロモシクロドデカン (HBCD) がターゲット基材として選択されました。 ハロゲン化有機化合物の分解プロセスでは、最初の脱ハロゲン化が最も重要なステップです。 ここで、HBCD の分解速度は HS9 株と比較して約 10 倍向上し、14 日間で 0.64 mg/L の分解速度でした。 Vmax-cyp168A1p12FdFNR の HBCD 分解速度は、HS922,23 の分解速度よりもはるかに速かった。 触媒酵素 CYP168A1 と電子供給酵素 フェレドキシン (Fd) およびフェレドキシン レダクターゼ (FNR) を含む塩誘導性 HBCD 分解モデルにおける電子供給の効率により、HBCD の分解速度は大幅に向上しました。 現在の研究では、海洋微生物 V. natriegens を宿主として使用し、成長のための環境因子 (Na + ) に依存する触媒酵素を発現させました。 遺伝子編集された細菌を環境内で使用すると、バイオセキュリティ上のリスクが生じる可能性があります。 これらは、不正アクセス、紛失、盗難、悪用、転用、または意図的な公開を指す場合があります。 バイオセキュリティ事故が発生すると、人間と自然に大きな脅威をもたらすことになります24。 私たちの研究は、環境放出を目的とした遺伝子組み換え細菌を構築する際の課題（実験室株の不十分な堅牢性、化学的誘導物質に依存した発現）に対処するのに役立ちます。

海洋マイクロプラスチック汚染の問題は広く注目を集めており、世界で新たに生じている環境問題のトップ 10 にランクされています。 これらのマイクロプラスチックは、サイズが小さく（直径 < 5 mm）、発生源が広範囲で、大量に放出され、金属や有毒有機汚染物質などの添加剤が放出されるため、重大な生物学的毒性をもたらします。 プラスチック廃棄物は沖合、海水、堆積物に広く分布しており、継続的に蓄積しています25。 クチナーゼ、リパーゼ、PETアーゼなど、多くの種類の PET 加水分解酵素がさまざまな微生物で研究されています。 海洋環境で PET を分解するバクテリアを操作するためのこれらの酵素の応用には限界があります。 しかし、固定化された細胞は、改善された触媒活性を示し、バイオレメディエーション時間を短縮し、バイオセキュリティのリスクを低減しながら生産コストを削減する可能性があります26。 私たちの研究では、モデル 3 で、PPM、MPP、LPT、および TPL 株が 0.5 × NSS 中で PET を分解でき、これらの組換え V. natriegens 株が海洋環境で PET 汚染を生物修復するために使用できることが示されました。

この研究は、海洋環境における高塩分ストレス下でのバイオレメディエーションに使用される天然微生物の低い増殖速度と分解速度に関する多くの懸念に対処するのに役立ちます。 海洋性 V. natriegens は、汚染された海洋環境の生物修復に優れた潜在力を持っているはずです。

クロルピリホス (CP、分析グレード ≥99%)、3,5,6-トリクロロ-2-ピリジノール (TCP、分析グレード ≥99%)、ポリエチレン テレフタレート (PET)、ビス-(2-ヒドロキシエチル) テレフタル酸 (BHET) 、およびモノ-(2-ヒドロキシエチル) テレフタル酸 (MHET) は Meryer (中国、上海) から購入しました。 1、2、5、6、9、10-ヘキサブロモシクロドデカン (HBCD、分析グレード 95% 以上) は、Anpel Laboratory Technologies (中国、上海) から購入しました。 この研究で使用した酢酸エチル、メタノール、その他すべての試薬と溶媒は分析グレードのものでした。

V. natriegens 株 Vmax は、Synthetic Genomic Company (カリフォルニア州カリパトリア) から購入しました。 緑膿菌 HS9 は研究室ストアから入手しました 22。 この研究で使用した最小塩培地 (MSM) には、(1 リットルあたり) 13.3 g Na2HPO4 ・12H2O、4 g KH2PO4、0.2 g MgSO4、2.0 g NH4Cl、9.5 g NaCl、および 0.5 mL の微量元素保存溶液が含まれていました。 微量元素保存溶液（1 リットルあたり） 0.05 g CaCl2・2H2O、0.05 g CuCl2・2H2O、0.008 g MnSO4・H2O、0.004 g FeS・7H2O、0.1 g ZnSO4、0.1 g Na2MuO4・2H2O、および 0.05 g K2WuO4・2H2O 、pH 7.0。 近塩溶液媒体（ＮＳＳ）は、（リットルあたり）８．８ｇのＮａＣｌ、０．７３５ｇのＮａ２ＳＯ４、０．１２５ｇのＫＣｌ、０．０２ｇのＫＢｒ、０．９３５ｇのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．２０５ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．００４ｇのＳｒＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、および０．００４ｇを含有した。 H3BO327。

トランスクリプトーム分析は、最終濃度 1% (w/v) および 5% (w/v) の NaCl を含む培地中でインキュベートした細胞の転写プロファイルを比較することによって実施されました。 Ｖｍａｘ株を、１Ｌの５％ＮａＣｌルリア・ベルターニブロス（ＬＢ５）を含む２Ｌフラスコ中で培養した。 対照群として、Vmax 株を溶原性ブロス (LB) で増殖させました。 すべてのサンプルは、30 °C の恒温シェーカー内で 200 rpm で培養されました。 トランスクリプトームシーケンスのために OD600 が 0.6 ～ 0.8 に達した時点で細胞を回収し、シーケンス前に液体窒素で凍結し、-80 °C で保存しました。 抽出された全 RNA は DNBSEQ プラットフォーム (BIG、深セン、中国) によって検出されました。 高塩濃度（5% NaCl）下で転写レベルが高い（上方制御倍率変化≧4）遺伝子を研究候補としてまとめた。 クリーンリードは、Hierarchical Indexing for Spliced Alignment of Transcripts (HISAT) プログラムによってゲノム配列と照合されました 28,29。

提案されたプロモーター (前部 400 bp 配列) の活性を決定するために、PstI 部位と EcoRI 部位の間にベクター pSK8k-mRFP をクローニングするために間隔領域をライゲーションしました。 補足表1に記載のプライマーを使用して、フロント配列をVmaxゲノムDNAから増幅しました。 2×ClonExpress MultiSワンステップクローニングキット（Vazyme、南京、中国）を使用して、精製断片を直鎖状pSK8k-mRFPにライゲーションしました。 プロモーター P1 および P2 を含む領域は、pS8K-mRFP にライゲーションすることによってさらに検証されました。 得られたベクターを電気形質転換によってVmax株に移し、コンピテントセルを次のように調製しました。Vmax株を3％LB中で増殖させ、細胞を30℃の恒温振盪機中で200rpmで培養し、OD600が0.6に達したときに回収しました。 –0.8 の場合、細胞を洗浄バッファー (7 mM K2HPO3 および 680 mM スクロース) で 2 回洗浄し、洗浄バッファーで再懸濁しました8。 GFP および RFP の蛍光強度は、マルチモード マイクロプレート リーダー 20 M (Tecan & Spark、スイス) を使用して、GFP については 510 nm で励起し、485 nm で発光を読み取り、GFP については 607 nm で励起し、584 nm で発光を読み取り、測定しました。 RFP30、31の場合。 細胞増殖は 600 nm で測定されました。 プロモーターの単位活性は次のように計算されました。

クロルピリホス (CP) 代謝に関与するコドン最適化遺伝子は、GENEWIZ Company (蘇州、中国) によって合成されました。 CP 分解遺伝子 mpd、tcpX、tcpA、dhpI、および dhpJ のアクセッション番号は、ABD92793.1、AGC65457.1、AGC65458.1、KC294623.1 (2341-3056)、および KC294623.1 (3081-3959) でした。それぞれ20、21。 HBCD 分解モデルでは、遺伝子 cyp168A1、4Fe-4S フェレドキシン (Fd)、および NAD(P)H 依存性フェレドキシン レダクターゼ (FNR) が緑膿菌 HS9 から増幅されました。 PET 加水分解酵素 PETase、MHETase、LCC、および Tfca は、参考文献 32、33、34、35 の配列をテンプレートとして GENEWIZ Company によって合成されました。 使用したすべてのプライマーを補足表 2 に示します。CP/HBCD 分解経路は、クローンベクター pAMmcs の EcoRI 部位と XhoI 部位の間に位置しました。 逆遺伝子 mpd/cyp168A1 はプロモーター P2-1 の制御下にあり、他の遺伝子 (tcpXA-dhpIJ/FdFNR) はプロモーター P1 によって制御され、それぞれ pAM-mpdp12tcpXA および pAM-cyp168A1p12FdFNR が得られました。 PETヒドロラーゼ、PETase32、MHETase33、LCC34およびTfca35は、プロモーター活性の同定と同じベクターpSK8k内に、プロモーターP1およびP2-2の制御下で構築されました。

Vmax 株への電気的形質転換後、単一クローンを PCR で検証し、Vmax-mpdp12tcpXA、Vmax-cyp168A1p12FdFNR、Vmax-PETaseP122MHETase (PPM)、Vmax-MHETaseP122PETase (MPP)、Vmax-LCCP122Tfca (LPT)、および Vmax-TfcaP122LCC ( TPL) を構築します。 PET、CP、または HBCD を分解する能力を測定するために、5% NaCl 溶原性ブロス (LB5) で対数期まで増殖させた操作株を収集し、0.5 × NSS 培地で 3 回洗浄し、0.5 × NSS で再懸濁しました。 最終的な光学濃度は、OD600 が 1.0 になるように調整されました。 1 グラムの PET (0.5 g のマイクロ PET、0.5 g の PET 膜を含む)、100 mg/L CP、または 1 mg/L HBCD を基質として 20 mL の細胞溶解物に個別に添加し、すべての反応を30℃で実施。 ２日ごとに１ｍＬの反応混合物を反応系から抽出した。 塩酸(1%)をサンプルに添加して反応を停止させた。 すべてのサンプルは使用するまで -80 °C で保存され、3 つの生物学的に独立したサンプルが各単一ポイントで検出されました 36,37。 粗酵素活性試験では、再懸濁した細胞懸濁液を高圧ホモジナイザー (APV-2000、ドイツ) を使用して 4 °C で破砕し、10,000 rpm で 40 分間遠心分離して細胞破片を除去しました。 基質として 1 グラムの PET を 20 mL の上清に添加し、PPM、MPP、LPT、および TPL コンストラクトとの反応を、それぞれ 44 °C および 55 °C でサーモスタットシェーカーを使用して実行しました。 また、2 時間ごとに反応系から 1 mL の反応混合物を抽出し、全細胞分解サンプルと同じ方法でサンプルを調製および検出しました。

キチン上への操作された Vmax 株の固定化は、生物学的漏出を回避し、分解するマイクロリソースの継続的なリサイクルを可能にするために行われました 38,39。 キチン結合タンパク質 GbpA をコードする遺伝子 (アクセッション番号 CP047296.1、755825-757282) を、プライマー GbpAF: 5'-ATGAAAAAACAACCT-3'、GbpAR: 5'-TTAACGTTTATCCCACG-3' を使用してコレラ菌から増幅しました 40,41。 増幅産物をpMD18T-Blunt Vector (TransGen Biotech、中国)に連結し、次いで大腸菌Top1042に形質転換した。 プラスミド抽出後、ユニバーサルプライマー M13F-GbpAF または M13R-GbpAR を使用して形質転換体の配列を決定しました。 得られたベクター、PMD18T-GBPAは、vmax-MPDP12TCPXA、VMAX-CYP168A1P12FDFNR、VMAX-PETASEP122MHETASE（PPM）、VMAX-MHETASEP122222PETASE（MPP）、VMAX-LCCP12TFCA（MPT）、VMAX-MHETASEP1222222222222TFNR、VMAX-MHETASEP122222TFCPCA（それぞれ2LCC（TPL） 、Vmax-GbpA-mpdp12tcpXA (VgCP)、Vmax-GbpA-cyp168A1p12FdFNR (VgHBCD)、Vmax-GbpA-PETaseP122MHETase (VgPPM)、Vmax-GbpA-MHETaseP122PETase (VgMPP)、Vmax-GbpA-LCCP122Tfca を形成します。 (VgLPT)、および Vmax- GbpA-TfcaP122LCC (VgTPL) コンストラクト。

改変株 Vg を LB5 で対数増殖期まで増殖させ、収集し、NSS 培地で 3 回洗浄しました。 次に、2 mL の細胞ペレットを 100 mg/L CP、10 mg/L HBCD、および 0.1 g マイクロ PET (mPET) を補充した 350 mL NSS で再懸濁しました。 得られた懸濁液を、５ｍＬガラス瓶中の０．３ｇの滅菌キチン（ＣＡＳ：１３９８－６１－４）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａｍｅｒｉｃａ）に加え、１ｍＬの０．５×ＮＳＳ緩衝液を反応系に加えた。 結合反応物を 30 °C で 3 日間静置してインキュベートしました。 リサイクル細菌の効率をテストするために、発生した HBCD 分解株をモジュールとして、残留 HBCD 濃度を検出することにより 3 回の HBCD 残留率を計算しました。 固形キチン結合細菌をＮＳＳ培地で３回洗浄し、再利用した（３０００ｒｐｍで２分間の遠心分離）。 キチン結合タンパク質 GbpA の機能により、改変株 Vg のキチンへの結合効率が向上しました。 キチンへのバイオマス結合は、(3-(4,5)-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド (MTT) アッセイキットを介して測定されました。 株をインキュベートし、100μLのMTT(5g/L)を添加し、暗所に4〜5時間保持し、その後、100μLのDMSOを添加し、570nmで読み取った。 死亡率が計算されました43。 添加した基質の濃度は、セクション 2.5 と同じ方法で検出しました。

CP および HBCD 分解用のサンプルは、まず保存サンプルに過剰の NaCl を添加することによって調製されました。 次いで、酢酸エチルを体積比１：１で加えて基質を抽出した。 次に、混合物をボルテックス発振器（YETO、vortex-2、中国）で30秒間ボルテックスし、続いて12,000 rpmで5分間遠心分離した。 有機相を検出に使用した。 PET 分解用のサンプルは、20% ジメチルスルホキシド (DMSO) を添加し、その後 CP および HBCD サンプルに使用したように抽出することによって調製されました。 CP の濃度と中間代謝物は、ガスクロマトグラフィー質量分析 (GC-MS) (Agilent & GC-7890B; MS-5977B) 検出によって検出されました。 注入前に、有機相を等量の BSTFA とともに 70 °C で 30 分間インキュベートしました 44。

HBCD は、Eclipse XDB C18 分析カラム (5 μm、4.6 × 150 μm、Keystone Scientific、Agilent) を備えた超高性能液体クロマトグラフィー四重極飛行時間型質量分析 (UPLC-TOF/MS) によって定量されました。 流速 0.25 mL/min の水とメタノールの移動相をターゲット化合物に適用しました。 移動相の比例勾配は 95% メタノールで開始し、25 分かけて 100% まで直線的に増加し、その後すぐに 95% まで減少して 10 分間保持しました。 質量分析では、イオン化源をネガティブ モードで実行し、MS 検出を m/z 0 ～ 1,700 に設定しました。 すべてのターゲット化合物は、m/z での水素付加イオン [M + H]- および臭素同位体の特性評価に基づいて抽出されました。

ビス-(2-ヒドロキシエチル) テレフタル酸 (BHET) およびモノ-(2-ヒドロキシエチル) テレフタル酸 (MHET) は、Eclipse XDB C18 分析カラム (5 μm、4.6 × 150 μm、Keystone Scientific、Agilent)。 流速 0.8 mL/min の 0.1% ギ酸を含む水とメタノールの移動相をターゲット化合物に適用しました。 移動相の比例勾配は 5% メタノールで開始し、12 分間で 44% まで直線的に増加し、次に 3 分で 70% まで直線的に増加し、さらに 3 分間保持してからすぐに 5% メタノールに戻しました。

バイオアンカーキチンの形態は、加速電圧 20 kV の走査型電子顕微鏡 (SEM) S3400II (日立、日本) によって観察および分析されました。 金でコーティングした後、すべてのサンプルを SEM サンプル プレートに貼り付け、個別に観察しました。 PET膜表面の外観の変化を原子間力顕微鏡（AFM）（NANOCUTE II、セイコーインスツルメンツ株式会社）を用いて測定し、平均サイズは10nmでした。 PETサンプルを蒸留水で3回洗浄し、その後エタノールで2回洗浄した。

すべてのアッセイは二重に実行され、少なくとも 3 回の独立した実験で繰り返されました。 濃度分解曲線は、GraphPad Prism 8.0 ソフトウェアを使用して生成されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

この研究の結果を裏付けるすべてのデータは、論文およびその補足情報ファイル (補足図 1、および補足表 1 ～ 3) で入手できます。 追加情報、関連データ、および固有の生物学的資料は、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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この研究は、中国国家重点研究開発プログラムからの助成金 (2021YFA0909500)、中国国立自然科学財団からの助成金 (32030004)、上海優秀学術リーダー プログラムの助成金 (20XD1421900)、および助成金 ( 17SG09) 上海教育開発財団と上海市教育委員会による曙光プログラム。

中国・上海市、上海交通大学微生物代謝国家重点研究所および生命科学・バイオテクノロジー学部

Ling Huang、Jun Ni、Ping Xu、Hongzhi Tang

CAS 定量工学生物学重点研究所、広東省合成ゲノミクス重点研究所および深セン合成ゲノミクス重点研究所、深セン合成生物学研究所、深セン先進技術研究所、中国科学院、深セン、中国

チャオ・ジョン＆ジュンビアオ・ダイ

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LH と HT は実験を考案し、計画しました。 LHは実験を行いました。 HT と PX はプロジェクトを受け取り、試薬と材料を提供しました。 LH と HT が論文を書きました。 LH、JN、HT、CZ、JD、および PX が議論し、原稿を修正しました。 すべての著者は投稿前に原稿にコメントを付けました。 著者全員が最終原稿を読んで承認しました。

Jun Ni または Hongzhi Tang との通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた Hendrik Ballerstedt と他の匿名の査読者に感謝します。 主な取り扱い編集者: Gene Chong。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Huang、L.、Ni、J.、Zhong、C. 他。 海洋ビブリオ・ナトリジェンスからの塩誘発バイオレメディエーション・プラットフォームの確立。 Commun Biol 5、1352 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s42003-022-04319-3

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受信日: 2022 年 6 月 20 日

受理日: 2022 年 11 月 29 日

公開日: 2022 年 12 月 9 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04319-3

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