特定の不利な状況下での硝化細菌の生存におけるアシルホモセリンラクトン（AHL）の潜在的な役割

Scientific Reports volume 13、記事番号: 705 (2023) この記事を引用

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1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

特に不利な状況下での硝化細菌の活動と生態におけるクオラムセンシング (QS) の潜在的な役割はほとんど報告されていません。 ここでは、アシルホモセリンラクトン（AHL）を添加または添加せずに、8 つの実験室規模の硝化シーケンスバッチ反応器をそれぞれ悪条件下で運転しました。 その結果、AHLの導入により硝化阻害剤（ジシアンジアミド、DCD）の存在下で窒素除去効率が大幅に向上し、低温（10℃）グループの安定期への移行が促進され、これら2つのグループにおけるAHLの利用効率が向上したことが示されました。グループ。 コミュニティ分析とqPCRにより、AHLが低温グループとDCDグループ、特にAOBの硝化細菌の存在量を大幅に増加させることがさらに確認されました。 ただし、通常の状態 (28 °C、pH = 8) または低 pH レベル (5.5) では、AHL は有意な影響を及ぼしませんでした。 正準対応分析により、硝化細菌が AHL に積極的に反応することが示され、AHL の添加が硝化プロセスを制御する効果的な戦略であることが示されました。 しかし、酸性条件下では、この調節機構の影響は顕著ではなく、システムに対する pH の影響が AHL の影響よりも大きいことが示されました。 この研究は、外因性 AHL が硝化細菌の競争力を高めて、より多くの資源を利用し、いくつかの不利な環境条件下で空間を占有する可能性があることを実証しました。

硝化細菌は、比較的弱い独立栄養性好気性細菌の一種で、世代周期が長く、生存環境への要求が高くなります。 低温 (< 15 °C)、pH、短い水圧滞留時間 (HRT)、遊離アンモニア (FA)、遊離亜硝酸 (FNA) など、いくつかの悪影響が硝化細菌の活性に影響を与える可能性があります 1,2。 さらに、下水処理場の流入水には、ジシアンジアミド（DCD、実際の都市下水処理場で頻繁に報告されている一般的なアンモニア酸化抑制剤）3 など、微量の硝化抑制剤（NI）が存在する可能性があります。硝化細菌の活動。 環境要因の変化も硝化プロセスに大きな影響を与え、システムが再び安定して稼働するまでには長い時間がかかると考えられます。 結果として、硝化システムに対する悪影響を迅速に回復することを検討することは、実用上非常に重要です。

クオラムセンシング（QS）は、シグナル分子の濃度を放出および感知することで細菌の生態学的関係と生理的行動を制御し、細菌内の関連遺伝子の発現を誘導し、単一の細菌では実現できない生理学的機能と制御機構を実現します。バイオフィルムの形成や二次代謝産物の生成など4、5、6。 細菌は環境ストレス下で生存するために上記の生理活性に依存しています7。 QS シグナル伝達物質の 1 つである N-アシル ホモセリン ラクトン (AHL) は、グラム陰性菌においてよく特徴付けられています 8,9。 現在、純粋培養および混合培養の両方で多くの硝化細菌が QS 効果を有しており、それらと QS との相関は遺伝子配列技術によって確認されています 10,11。 多くのアンモニア酸化細菌 (AOB) 上清溶液の純粋培養では、Nitrosomonas europaea や Nitrosospira multiformis などの AHL が生成される可能性があります 11,12。 AHL は、メンブレンバイオリアクター (MBR)、硝化バイオフィルム、および独立栄養性硝化バイオフィルムでも検出されました 13、14、15。 一部の AOB は AHL を産生しませんが (AHL 受容体遺伝子あり、AHL 合成酵素遺伝子なし)、外因性 AHL12 を使用できます。 別の AOB モデル生物である Nitrosospira multiformis は、C4-HSL および 3-o-C14-HSL シグナル伝達分子を産生できる LuxI/R 型 QS シグナル伝達合成酵素および制御因子を持っていることが最近判明しました 16。 ユウら。 MBR の QS を阻害するためにクオラム クエンチングを強化すると硝化効果が減少することがわかり、硝化に対する QS の重要性が間接的に証明されました 17。 これらの研究は、硝化細菌と QS の間に強い関係があることを示しました。 したがって、環境ストレス下で細菌が生存するために非常に重要である QS が、ストレス条件下での硝化細菌の活性と窒素除去を改善する可能性があると疑うのは合理的です。

低温、低 pH レベル、DCD の存在などの特定の悪条件下での細菌の挙動と硝化細菌の特性に対する AHL の潜在的な調節的役割を評価するために、AHL を添加した場合と添加しない場合の 8 つのバッチ試験が実施されました。 追加された AHL シグナル分子の種類はそれぞれ C6-HSL と C8-HSL であり、検出結果によれば、これらがシステム内で優勢でした。 AHLを投与した窒素除去能力とQS活性を調べ、AOBと亜硝酸酸化細菌（NOB）の数、細菌群集と多様性を分析し、硝化微生物に対する外因性シグナルの考えられるメカニズムを提案した。 この研究の目的は、窒素除去に対する AHL の影響を調査し、最終的にストレスの多い条件下で硝化細菌の活性を高める戦略を提案することです。

この研究で使用したシグナル伝達分子（N-ヘキサノイル-1-ホモセリンラクトン（C6-HSL）およびN-オクタノイル-1-ホモセリンラクトン（C8-HSL））は、Sigma-Aldrich（中国）から購入しました。 AHL をストック溶液として最終濃度 1 g/L でメタノールに溶解し、ギ酸を 0.1% 濃度 (v/v) で添加しました。 DCD は Sigma-Aldrich から購入しました。

硝化細菌接種材料の調製には、有効容量 6 L の全自動シーケンス バッチ リアクター (SBR) 1 台を使用しました。 反応器のサイクル時間は、以下の段階からなる８時間であった：３０分間の供給、４時間の曝気、２時間の無酸素状態、１時間の沈降および３０分間のデカント。 種子汚泥は武漢市の下水処理場の沈殿槽の返送汚泥から得た。 合成原料溶液の詳細を補足表S1に示します。 NH4+-N の濃度は最初 25 mg/L でしたが、2 週間の培養後に 50 mg/L に増加し、2 週間そのままで、その後最終濃度 100 mg/L まで上昇しました。 pHレベルはNa2CO3によって8.0に維持された。 溶存酸素 (DO) 濃度は、エアフローメーターを使用して約 2.0 ～ 4.0 mg/L (曝気) で変化しました。 温度はサーモスタットヒーター（GDH-4006、SCIENTZ）で28℃の範囲でした。 アンモニウムの約 65% が酸化された時点で硝化細菌を回収し、上清中に AHL を検出しました。

8 台の 1000 mL 自動 SBR に 300 mL の合成原料溶液と 300 mL の硝化細菌接種材料を充填し、平均して正常グループ (N-BR および N-ER)、酸性グループ (A-BR および A-ER) の 4 つのグループに分けます。 、DCD グループ (D-BR および D-ER) と低温グループ (L-BR および L-ER)。 1 μM AHLs 混合物 (C6-HSL および C8-HSL 等量混合) を充填したフラスコを実験リアクター (ER) とし、AHL を含まないフラスコをブランクリアクター (BR) としました。 リアクターは「接種材料の調製」と同じ方法で操作します。 4 つのグループの詳細を補足表 S2 に示します。 流入水の NH4+-N 濃度は 100 mg/L です。 添加された AHL の種類は反応器内の優勢な種類に従って確認され、AHL の添加濃度は関連文献 10、17 に従って決定されました。 ＡＨＬ混合物を、供給段階中に１日１回フラスコに添加した。 すべてのフラスコを 2.2 で述べたように 20 日間操作しました。

アンモニア態窒素 (NH4+-N)、亜硝酸態窒素 (NO2-N) および硝酸態窒素 (NO3-N) を標準的な方法に従って 2 日ごとに測定し (APHA、2005)、各指標の除去効率を式に従って計算しました。 。 (1)。 混合液懸濁物質 (MLSS) は、2 日に 1 回、105 °C で 12 時間乾燥すると定義されました。 DO と pH は、マルチパラメーター水質分析装置 (HQ30D、HACH、米国) によって測定されました。 遊離アンモニア (FA) および遊離亜硝酸 (FNA) の濃度は、式 1 に従って計算されました。 (2)と(3)。 SPSS ソフトウェア (バージョン 19.0) を適用して T 検定を実行し、さまざまなサンプル間の差異をテストしました。p < 0.05 の場合、差異は統計的に有意であるとみなされました。

Li et al.18 に従って、硝化細菌接種材料中の AHL を上清から抽出し、C18 カラム (Agilent、America) を使用した固相抽出 (SPE) によって濃縮しました。 AHL 濃度は、エレクトロスプレー イオン化源 (ESI) を備えた超高性能液体クロマトグラフィー (UPLC) によって分析されました。 標準的な AHL の詳細な方法は、以前の研究に従っています 19。

システム内での AHL の分解を評価するために、500 mL の活性汚泥を N-BR および A-BR から取り出し、ビーカー内で別々に不活化しました。 次に、1μMのC6-HSLおよびC8-HSLをビーカーに添加した。 混合物を振盪機中、28℃、120rpmで24時間インキュベートした。 定期的に混合物をビーカーから取り出して、AHL の濃度を測定します。

DNA抽出はDNeasy PowerSoil Pro Kit（QIAGEN、ドイツ）を用いて実施した。 核酸濃度は分光光度計(NanoDrop)により測定した。 16S rDNA の配列決定は、Sangon Biotech (中国、上海) の Illumina HiSeq 2500 システムで実行されました。 プライマー配列は、338F (5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3') および 806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3') で、最終濃度は 5 μmol/L でした。

全 DNA 抽出は、「コミュニティ構成のハイスループット シーケンス解析」で述べたように実行されました。 16s rRNA 遺伝子、amoA 遺伝子、および nxr 遺伝子の増幅に使用されるプライマーを補足表 S3 に示します。 増幅手順の確立および反応系の構築は、PerfectStart Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech、中国) の指示に従って行われました。 各 PCR 反応の最終容量は 20 μL で、これには次のものが含まれていました: SYBR Green PCR マスター ミックス (Applied Biosystems, USA) 12.5 μL、鋳型 DNA (抽出した DNA を 100 倍に希釈したもの) 3 μL、順方向および逆方向のそれぞれプライマー 1 μL、および ddH2O 2.5 μL。 次に、配列検出システム（ABI Prism 7500）によりPCR増幅を行った。 qPCR では 2 段階の方法を使用しました: 94 °C で 30 秒の変性、94 °C で 5 秒、60 °C で 30 秒のサイクルを 40 サイクル。 増幅産物の特異性を決定するために、すべての qPCR 実行の最後に融解曲線分析を実行しました。

初期の NH4+-N 濃度は約 99.08 ± 0.52 mg/L でした。 経時的なアンモニア除去傾向は、N-BR と N-ER を除くすべてのテストで非常に類似しており、最初の 2 日間の除去効率は他のグループよりわずかに速かった (図 1a)。 これに続いて、すべてのテストでアンモニア除去効率が著しく向上しました。 N-ER および L-ER の NH4+-N 除去効率は実験終了時点で約 99% であり、N-BR および L-BR と比較して有意な増加はありませんでした (p = 0.055)。安定期は BR よりも早く、このような環境では AOB の QS への依存度が強くないことを示しています。 不利な環境下で 20 日間培養したところ、DCD 群および酸性群の NH4+-N 除去効率は正常群に比べて有意に低かった。 酸のリアクター間の NH4+-N 除去効率には有意な差は見られず (p = 0.649)、実験終了時点でそれぞれ BR で約 47%、ER で約 48% でした。 アンモニア変換効率が低いのは、FNA の効果によるものと考えられます。 酸性グループのFNA濃度は0.15〜0.64の範囲であり、阻害閾値0.02 mg/L24より高かったが、他のグループのFNAは阻害閾値未満であった（図2a）。 ただし、DCD グループのテストでは、外因性 AHL を添加したリアクターでは NH4+-N 除去に変化が見られ (p < 0.05)、最終的な NH4+-N 除去効率は 59% (BR) および 72% (ER) でした。それぞれ。

4つのグループの運転期間中の活性汚泥の性能。 N ノーマルグループ、A 酸性グループ、D DCD グループ、L 低温グループ、BR ブランクリアクター、ER 実験リアクター。 エラーバーは平均値の標準誤差として定義されます (n = 3、生物学的反復)。

運転中の活性汚泥の 4 つのグループの FA および FNA レベル。 N ノーマルグループ、A 酸性グループ、D DCD グループ、L 低温グループ、BR ブランクリアクター、ER 実験リアクター。 エラーバーは平均値の標準誤差として定義されます (n = 3、生物学的反復)。

NO2-NおよびNO3-Nに対するAHL添加の影響もすべてのバッチテストで検査されました（図1b、c）。 明らかに、NO2-N および NO3-N の形成は、NH4+-N の減少に伴って起こりました。 正常群ではFA濃度（< 6 mg/L）とFNA濃度（< 0.02 mg/L）が低いため（図2a、b）、NO2-Nレベルの減少に伴い、NO3-Nレベルの急激な増加が見られました。 実験終了時の NO3-N 濃度は約 86 mg/L でした。 これらの結果は、NH4+-N 除去効率と一致しました。 一部の研究者は、NOB の FA および FNA24 に対する耐性が低いことを証明しています。 FA レベルが 6 mg/L を超えるか、FNA 濃度が 0.02 mg/L を超える場合、阻害されます。 したがって、正常群の NOB は FA および FNA によって阻害されず、ほとんどすべての亜硝酸塩が硝酸塩に変換されました。 酸グループ 2 の反応器における NO2-N および NO3-N 濃度の変化は類似しており、およそ 27 ～ 29 mg/L および 5 ～ 7 mg/L で安定しており、NOB の活性が阻害されたことを示しています。 NO2-N と NO3-N は、D-BR と D-ER に有意な差を示しました。 流出 NO2-N および NO3-N の濃度は、D-BR では 39.3 ± 2.21 および 6.51 ± 1.95 mg/L、D-ER では 17.52 ± 2.31 および 40.49 ± 1.79 mg/L でした。 これらの結果は、AHL の添加が NOB に対する DCD の阻害を効果的に軽減し、NO2-N の変換を促進することを示しました。 低温グループでは、実験の開始時に両方の反応器でNO2-Nの蓄積が発生し、その後徐々にNO3-Nに変化しましたが、L-ERはL-BRよりも早くNO2-Nの蓄積を軽減しました。 このプロセス中に、FNA と FA の濃度は NOB の阻害閾値を下回るレベルに達し、L-ER 内の NO2-N 濃度が低下します。 さらに、DCD 群と低温群の間の NO2-N および NO3-N レベルの有意な差は、前述の AOB 活性に起因する可能性があります。

最初の廃水では 5 種類の AHL、すなわち C4-HSL、C6-HSL、C7-HSL、C8-HSL、3-オキソ-C12-HSL が検出されました。 このうち C6-HSL と C8-HSL は系内で優勢であり、硝化細菌系やその他の水処理施設に広く存在することが確認されているため、本実験ではこれら 2 つの AHL を主に検討した12,20。 C6-HSL および C8-HSL の濃度はテスト中安定しており、すべてのバッチ条件で 13.34 ～ 34.85 nM の範囲でした。 異なる条件下での細菌によるAHLの利用を決定するために、最初にブランク対照として24時間以内のAHLの分解を検出した。 図3a、bからわかるように、C6-HSLの分解効率は、同じ条件下ではC8-HSLの分解効率よりも大幅に低く、酸性条件下でのAHLレベルは大幅に高かった。 実験の終了時点で、C6-HSL は 53% (pH 8.0) と 38% (pH 5.5) 分解され、C8-HSL は 56% (pH 8.0) と 46% (pH 5.5) でした。 活性汚泥は不活化されているため、活性汚泥の吸着により信号分子が劣化する可能性があります。 これは Tan らの調査と一致しています 21。 さらに、pH 8.0 と pH 5.5 の間の分解効率の違いは、アルカリ条件下で AHL が分解しやすいことによって説明される可能性があります 22。

UPLC-MS/MS による 4 つのグループの反応器における汚泥上清サンプル中の AHL の分解と使用の検出。 (a) pH = 8.0 の場合の 24 時間での AHL の分解。 (b) pH = 5.5 の場合の 24 時間での AHL の分解。 (c) 4 つの AHL 添加反応器における C6-HSL の使用。 d: 4 つの AHL 添加反応器における C8-HSL の使用。 N ノーマルグループ、A 酸性グループ、D DCD グループ、L 低温グループ、ER 実験炉。 エラーバーは平均値の標準誤差として定義されます (n = 3、生物学的反復)。

2種類のAHLを異なるシステムに20日間添加した後、システム内のAHLの分解効率が変化しました（図3c、d）。 追加された濃度はシステムによって生成された濃度 (13.34 ～ 34.85 nM) よりもはるかに高かったため、元の濃度は無視されました。 N-ER では、C6-HSL と C8-HSL の分解効率は 60% と 62% に変化し、それぞれ 11.7% と 9.7% 増加しました。 分解効率の増加は、添加された AHL の一部が細菌によって利用されたことを示唆しています。 酸性環境（pH 5.5）では、C8-HSL の分解効率は 46 % から 50% にわずかに増加しましたが、C6-HSL の分解効率は約 38% に留まりました。 実験結果からわかるように、酸性条件下では細菌の増殖が阻害され、AHLの利用効率が低くなり、このシステムのQS活性が低いことがわかりました。 DCD グループと低温グループでも顕著な変化が検出されました。 2 つの AHL の分解効率は明らかに増加し、D-ER では C6-HSL の 62% と C8-HSL の 69%、L-ER では C6-HSL の 65% と C8-HSL の 74% がそれぞれ増加しました。 AHL は細菌によって利用されました。 上記の結果は、AHL が硝化細菌の活性と相関している可能性があることを示唆しており、これは窒素除去プロセスの結果と一致しています。

AHL の添加によりバッチ反応器の窒素除去効率が大きく変化することを考慮すると、硝化細菌の活性に対する外因性 AHL の影響を分析する必要がありました。 図 4 に示すように、AOB とニトロスピラの量はすべてのグループで一貫して優勢でした。 全細菌中のAOBとニトロスピラの割合は、AHLを追加した後、正常群でわずかに減少傾向を示し、AOBは16.98％（BR）から12.03％（ER）に、ニトロスピラは11.73％（BR）から10.44％（ER）に、これは、AHL が硝化細菌の存在量を増加させなかったことを示しています。 同様に、AHLの添加は、AOBとNOBの存在量がそれぞれBRで4.46%と1.94%、ERで5.09%と2.04%であったため、pH 5.5でのAOBとニトロスピラ数の両方の減少を明らかに逆転させることはなかった。 しかし、1 μM AHL を添加した後、DCD および低温グループの AOB および NOB バイオマスは大幅に増加し、特に AOB の割合が 9.4% (D-BR) および 27.14% (L-BR) から 11.22% (D-ER) に増加しました。 ) と 33.31% (L-ER)。 同時に、DCD および低温グループでは総細菌バイオマスの有意な増加はありませんでした (データは示されていません)。 AOB のこの明らかな増加は、システムに対する AHL の重要な影響であると考えられました。 低温での硝化細菌の存在量は通常のグループ、特にAOBよりも一般に高く、これは室温と低温でのAHLの異なる制御戦略をさらに反映していることは注目に値します。 反応器の性能を考慮すると、AHL は低温での環境圧力に応答して硝化細菌の存在量を増加させる傾向があると推測されました。

4つのグループにおける全細菌に対するAOBとNOBの存在比。 N ノーマルグループ、A 酸性グループ、D DCD グループ、L 低温グループ、BR ブランクリアクター、ER 実験リアクター。

表 1 から、サンプルの高い Good's カバレッジ (98% 以上) は、結果が汚泥サンプルの微生物成分を表していることを示しています。 4 つのグループの実験リアクターでは、より高い Chao1 および ACE 値が観察され、これはより豊富な濃度であることを意味します。 シャノンとシンプソンのサンプルは、異なる環境で硝化細菌を培養中に変化しました。 種の多様性は、酸性グループでは大幅に減少しましたが、低温および DCD グループでは大幅に増加しました。 注目すべきことに、３つのグループ（酸グループを除く）の間で、ＡＨＬ添加リアクターにおける多様性指数は、対照リアクターにおける多様性指数よりも高かった。

8 つのリアクターからのハイスループット シーケンス プロファイルを比較すると、細菌の組成に大きな違いがあることが示されました (図 5a)。 RDP 分類子を使用したすべてのサンプルにわたる合計 36 の細菌属が、フィルター処理されたシーケンスから同定されました。 ニトロソモナス、ドクドネラ、Ns9 メイン グループ、テリモナス、テトラスファエラ、サーモモナスが主要な細菌で、細菌群集の約 5% ～ 13% (相対存在量) を占めていました。 AHL を使用した 20 日間の培養後、ニトロソモナスとニトロスピラの相対存在量は両方とも 20% 以上増加し、ニトロスピラがそれぞれ 53.9%、53.8%、43.8%、28.3% という最も高い相対存在量を獲得しました。 ニトロソモナスは、アンモニウム濃度が低い下水処理施設でよく見られます。 この属の相対存在量は通常、NH4+-N が低いときに達成されます。 ニトロスピラは、下水処理場や実験室の反応器に存在する主要な亜硝酸酸化細菌です。 これら 2 つの細菌存在量の変化は、「不利な状況下での硝化に対する AHL の影響」に記載されている窒素分解効率の変化と一致していました。 これら 2 つの細菌の存在量が常温よりも低温で有意に高かったことは注目に値します。これは、「硝化細菌の相対存在量に対する AHL 添加の影響」の結果と一致しています。 Ns9 メイングループの存在量はすべての実験グループで大幅に減少し、この属が AHL によって阻害される可能性があることを示唆しています。 これらの属の大きな変動は、AHL の摂食の結果である可能性があり、外因性 AHL が細菌群集の変化に重要な要素である可能性があることを示しています。

細菌組成と、環境要因と 8 つの原子炉間のコミュニティ間の標準対応分析。 (a) 異なる反応器の汚泥中の細菌群集の分布。 (b) 環境要因と細菌群集の間の標準対応分析。 N ノーマルグループ、A 酸性グループ、D DCD グループ、L 低温グループ、BR ブランクリアクター、ER 実験リアクター。

水質や環境要因（pH、温度、硝化阻害剤など）に影響される細菌群集の変動は、正準対応分析（CCA）によって説明されました。 バイプロット図は、図5bの4つの培養プロセス中の環境要因と種重量が5％を超える細菌の組成との関係を強調しています。 DCD と NO2-N 濃度は細菌群集の分布に最も大きな影響を与えましたが、NH4+-N 濃度は最も影響が小さく、これは 4 つの動作条件下での NH4+-N の分解効率が高いことも説明していますが、NO2-N は細菌群集の分布に蓄積しました。いくつかのグループ。 システム内の優勢なバクテリアのほとんど (ドクドネラ、Ns9 メイン グループ、テリモナス、テトラスファエラ、サーモモナス) は pH と有意に負の相関があり、低 pH で操作するとシステムの処理が不十分になります。 硝化細菌と AHL の間に有意な正の相関関係があったことは注目に値します。これは、AHL の添加が硝化プロセスを大幅に促進できることを示しています。 したがって、結果は、硝化細菌群集が、AHL 添加期間中に徐々にかつ高度に影響を受けることを確認しました。

生物学的廃水処理施設では、QS がバクテリアの密度を制御し、その集団行動を組織します。これは、活性汚泥、微生物群集、反応器の性能にも重要な影響を与えます。 多くの研究により、WWT における硝化細菌の多くの生理学的機能が AHL ベースの QS10、11、12、13、14、15 に関連していることが確認されています。 シグナル分子の検出により、この結論がさらに確認されました。 AOB によって生成されるいくつかのタイプの AHL は、以前の研究で上清中で実証されていました 23。 しかし、硝化細菌における AHLs 媒介 QS の作用に関する利用可能な報告は非常に限られており、特に不利な増殖条件にある硝化細菌については限られています。 QS が硝化細菌の活性の回復を促進できるかどうかについては、さらなる研究が必要です。 したがって、我々は、悪条件下での細菌の行動と硝化細菌の特性の調節に対する AHL の潜在的な影響を推定することを試みました。 私たちのデータは、不適切な条件下で硝化細菌に対する AHL の顕著な促進を示しました。 DCD 存在下および低温下での AHL 媒介 QS の積極的な役割が判明しており、この条件下ではすべての細菌における AOB および NOB の割合が大幅に増加し、したがって悪条件下でのシステムの効率が向上します。 しかし、通常の培養条件や酸性条件下ではその効果は顕著ではありませんでした。

環境要因は AHL の有効性に大きな影響を与えるため、周囲環境における AHL ベースの QS のレベルに影響を与えます。 pH が AOB および NOB の増殖に寄与しない場合、AOB に対する pH の影響は、AOB に対する AHL よりも強いため、外因性 AHL の促進効果は有意ではありません。 低 pH システム間の NH4+-N 除去効率と NO2-N および NO3-N の生成効率は、ほぼ低いレベルに維持されました。 一方、pH 5.5での汚泥の培養では、AHLを添加しても総細菌数とAOB&NOB数の減少の両方が明らかに逆転しないことが実証されました。 低 pH システムとその他のシステムの間で NH4+-N および NO2-N 変換効率が異なるのは、FNA の影響によるものと考えられます。 以前の研究では、FNA レベルが 0.1 mg/L に達すると AOB の生合成が阻害され、NOB は FNA に対する感受性が高く、FNA レベルが 0.02 mg/L に達すると阻害されることが示されました 24。 3.1 および 3.2 の実験結果と組み合わせると、酸性条件下で高濃度の FNA が細菌の増殖を抑制したことがわかります。 FNA 濃度は酸系で 0.13 ～ 0.64 の範囲にあり、前述の阻害閾値より高かったが、他のグループの FNA は 0.02 mg/L 未満でした。 周囲の環境が細菌の生育に適している場合、細菌の活性と細菌が分泌するシグナル分子の濃度はいずれも適切な範囲内にあります。 したがって、細菌に対する外因性 AHL の促進は有意ではなく、N-BR と N-ER の間に有意差はありませんでした (p < 0.05)。 低温下や阻害剤存在下では硝化菌の活性が阻害され、AHLの利用効率が低下します。 AHL 添加後、硝化細菌の活性が増加し、周囲のシグナル分子の利用がより十分になるため、細菌集団全体に占める AOB と NOB の割合が増加し、AOB と NOB が共生細菌との競合において徐々に優勢になっていることを示しています。細菌。 これは、Li et al.によっても示されたとおりです。 アンモニアの除去には、AHL の投与と同様の効果があることがわかりました 10。 微生物の QS システムは通常、資源と空間の合理的な利用において重要な役割を果たします 25,26。 QS システムは硝化細菌の増殖を制御することができ、より多くのスペースと資源を占有し、一部の悪環境条件下では AOB と NOB が優勢な株になります。

現時点では、AHL が何らかの悪環境条件下で硝化細菌にどのように作用するかは明らかではありません。 1 つの仮説は、AHL が細菌群集を制御し、それによって共生関係に影響を及ぼし、硝化汚泥中の硝化細菌に変化をもたらす可能性があるというものです。 この研究では、硝化細菌群集の機能と構造が AHL に対して非常に敏感であることが判明しました。 システムが低温または DCD の存在下にある場合、AHL の外因性添加によって生成される遺伝子発現が細菌の個人レベルまたは集団レベルで記録されていました。 ただし、コミュニティのメンバー全員が同様に AHL の影響を受けたわけではないことは注目に値します。 AHLの追加研究では、最も人口の多いコミュニティメンバーの上位36人はAHLに対して異なる反応を示しました。 この現象は他の研究でも観察されていました21。 さらに、以前の研究では、AHL 生産者は AHL の添加に対してより感受性が高いことが示されています。 この研究では、ニトロソモナス、ニトロスピラ、フェルギニバクター、タウエラ、ハイフォミクロビウム、マイコプラズマ、バチルスを含む7つの細菌の存在量がAHLの外因性添加後に増加しましたが、これらの細菌のほとんどはシグナル伝達分子の産生を報告していませんでした。 群集の構造、機能、構成の影響については、さらなる研究で十分に取り組む必要があります。 AOB によって生成されるいくつかのタイプの AHL は、以前の研究で上清中で実証されていました 23。 Nitrosomonas europaea のバイオフィルム形成は QS と密接に関連しており、外因性 AHL の添加は飢餓状態での活性の迅速な回復に役立ちます。 しかし、この細菌では AHL シンターゼ相同体は検出されず、Nitrosomonas europaea が AHL を利用して別の方法で AHL を合成できることが示唆されました 12,27。 これらの研究は、AHLの存在がストレス条件下でAOBのAHL誘発活性を増強する可能性があることを示しており、このことは細菌によるAHLの利用効率に関するバッチ試験でも再度確認された。 この現象の背後にあるメカニズムはさらに調査する必要がありますが、これらの結果は、硝化細菌が不利な生活条件を克服するためにAHLの使用を増加させる可能性を示唆しました。 ただし、AHL の追加方法はすべての条件で機能するとは限りません。 良好な増殖状態では、AHL 添加システムにおける NH4+-N 除去効率は有意に増加しなかったため、硝化細菌は QS に強く依存しませんでした。 シグナル分子は濃度依存性がなく、シグナル分子の適切な添加は群集の安定性と汚染物質の除去の促進に役立つ可能性があります19。 上記の結果と組み合わせると、AHL の添加戦略は、他の環境要因、特に pH 値とともに考慮する必要があります。

この研究により、特定の悪条件（低温、低 pH レベル、および DCD の存在）下での硝化細菌群集の生存における AHL の潜在的な役割が明らかになりました。 AHLで治療したDCDグループと低温グループはより良いパフォーマンスを示し、硝化菌の存在量とQS活性は対照グループよりも有意に高かった。 群集分析と qPCR は、QS が硝化細菌種を強化することによって群集再構築において機能的な役割を果たしている可能性があることを示しました。 ただし、通常の条件 (28 °C、pH = 8) または酸性の条件 (pH 5.5) で AHL を添加しても、システムに大きな変化はありませんでした。これは、通常の条件下では細菌の活性が強く、さらなる改善の余地が限られているためと考えられます。そして、硝化細菌に対する酸性条件の影響は、AHLの影響よりも大きかった。 したがって、不利な要因の下での硝化に対する AHL の制御戦略は、システムの pH 値と組み合わせて考慮される必要があります。

現在の研究中に生成および/または分析されたデータセットは、進行中の研究の一部でもあるため一般には公開されていませんが、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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何よりもまず、この研究の予備試験に対する支援と提案をいただいたマイク・マネフィールド教授に深く感謝いたします。 この研究は、中国国立自然科学財団 (助成金番号 51808200) および湖北省重点研究所建設基金 (地域開発と環境対応のための湖北重点研究所開設基金、助成金番号 2019(A)001) によって支援されました。

武漢計画設計有限公司、武漢、430010、中国

曾香国

湖北大学資源環境科学部、武漢、430062、中国

胡恵志

湖北省地域開発および環境対応重点研究所、武漢、430062、中国

胡恵志

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XZ: 概念化、ソフトウェア、調査、データキュレーション、執筆 - 原案。 HH: 調査、データのキュレーション、執筆、レビューと編集、監督、資金調達。

胡恵志氏への対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Zeng, X.、Hu, H. 特定の不利な状況下での硝化細菌の生存におけるアシルホモセリンラクトン (AHL) の潜在的な役割。 Sci Rep 13、705 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-23123-x

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受信日: 2022 年 5 月 27 日

受理日: 2022 年 10 月 25 日

公開日: 2023 年 2 月 6 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-23123-x

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