ハイブリッド反応器におけるバイオフィルムおよび活性汚泥における微生物群集の発達

Scientific Reports volume 12、記事番号: 12558 (2022) この記事を引用

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1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

微生物は生物学的廃水処理において重要な役割を果たします。バイオマスが発生する形態は、さまざまな微生物構造の異なる条件により、有機化合物の変換の効率とメカニズムを決定します。しかし、バイオフィルムと活性汚泥の微生物群集を比較した研究の結果は、多くの場合矛盾しています。したがって、この研究では、16S rRNA シーケンスを使用して、ハイブリッド反応器内のバイオフィルムと活性汚泥における細菌群集の組成と発達を比較しました。配列データの統計分析には、バイオフィルムおよび活性汚泥に特徴的な分類群の同定、アルファおよびベータ多様性分析、およびネットワーク分析が含まれます。これらの分析は、バイオフィルム細菌群集が活性汚泥群集よりも豊かで多様であることを示しました。 OTU の平均数はバイオフィルムで 1614、活性汚泥で 993 であり、Chao1 (1735 vs. 1105) および Shannon (5.3 vs. 4.3) 生物多様性指数の平均値はバイオフィルムの方が有意に高かった。バイオフィルムは、硝化菌 (ニトロソモナス、ニトロスピラなど) やリンを蓄積する微生物 (カンジダタスアキュムリバクター) の発生にとってより良い環境でした。バイオフィルム共起ネットワーク内の細菌は、相互により多くの接続を有しており (スピアマンの順位相関係数に基づく)、活性汚泥内の細菌よりも相互作用が高いことを示しています。

活性汚泥内とバイオフィルム内での微生物の増殖を組み合わせたハイブリッド生物反応器は、さまざまな構成で廃水処理に広く使用されています。最も一般的なタイプのハイブリッドバイオリアクターでは、曝気タンクに追加された移動キャリア上でバイオフィルムが成長しますが、回転生物学的接触装置や浸漬床などの他の技術ソリューションを備えたシステムもあります。ハイブリッド技術によるバイオリアクターを使用することで、バイオマスの濃度が高まり、廃水処理の効率が向上します。このタイプの技術の一例は、従来の配列決定バッチ反応器技術を改良した統合固定膜活性汚泥移動床配列決定バッチバイオフィルム反応器 (IFAS-MBSBBR) です。この反応器では、両方の形態のバイオマスが同じタンク内に共存します。この技術の主な利点は、汚泥の膨張がなくなることと、より多くの汚染物質を受け入れる可能性があることです1。

使用される技術的ソリューションに関係なく、微生物は生物学的廃水処理において重要な役割を果たします。微生物群集の形成は、運転条件や流入する廃水の組成など、多くの要因の影響を受けます2。汚染物質除去の効率とプロセス全体のパフォーマンスに影響を与える重要な要素は、汚泥の年齢です。汚泥の寿命は固体保持時間 (SRT) とも呼ばれ、固体画分 (バクテリア) が反応器内で費やす時間です。細菌のグループごとに増殖に最適な時間が異なり、SRT が短すぎると細菌がシステムから洗い流されてしまいます。増殖に必要な時間に関する細菌の要件はまったく異なります。長い SRT は硝化細菌と糸状細菌の発生に有利ですが、短い SRT はリン蓄積細菌と脱窒細菌に有利です 3,4,5。バイオマスが発生する形式も同様です微生物群集の最終構造に大きな影響を与えます。生物膜の条件は活性汚泥の条件とは異なります。たとえば、生物膜には酸素と栄養素の濃度勾配があり、これらの物質は生物膜の深層に到達する量が少なくなります。したがって、活性汚泥とバイオフィルムは異なる汚染物質除去メカニズムを持っています6。バイオフィルムの最適な厚さは廃水処理プロセスのパフォーマンスにとって非常に重要です。薄すぎると、脱窒細菌が増殖するための無酸素状態が提供されません。厚すぎると、栄養素へのアクセスを制限する障壁として機能するため、硝化バクテリアにとって不利になります7。微生物群集の形態は、その発生段階によっても決まります。活性汚泥とバイオフィルムの両方において、細菌の個々のグループの割合は、成熟プロセスが進むにつれて変化します。

分子技術と次世代シーケンスの進歩により、廃水処理システムにおける複雑な細菌群集の研究が容易になりました。環境微生物学の研究で最も一般的に使用されるアプローチの 1 つは、16S rRNA 遺伝子の配列決定です。得られた配列を広範なデータベースで入手可能な配列と比較することにより、環境サンプル中に存在する細菌を識別することが可能です。 16S rRNA 遺伝子配列決定により、微生物群集全体に関する膨大な量の情報が生成され、その分類学的構成を定義できるようになります。ただし、このアプローチでは、活性遺伝子や代謝経路に関する情報は得られません。したがって、遺伝子発現を研究し、微生物群集の機能プロファイルを作成するには、メタトランスクリプトミクスなどの RNA ベースの方法を使用する必要があります。 16S rRNA 遺伝子配列決定により、特定の群集を形成する微生物の存在量を推定することができますが、そのメンバー間の関係やその発達に影響を与える要因に関する情報は提供できません 8。微生物間の相互作用を研究するための 1 つの方法は、研究対象の群集を表すネットワークを作成することです。これにより、微生物の包括的な分析が可能になります。このようなネットワーク内のノードは、運用分類単位 (OTU) を象徴します。ノードはエッジによって互いにリンクされており、ノード間の相互作用 (ほとんどの場合、豊富な相関) を表します。ネットワークの視覚化と分析により、研究対象の群集における主要な分類群だけでなく、潜在的に相互依存する分類群や、潜在的に相互に競合する分類群を決定することができます。

現在、バイオフィルムコミュニティと活性汚泥コミュニティを比較するいくつかの研究が発表されていますが、これらの研究の結果はしばしば矛盾しています。例えば、いくつかの研究では、バイオフィルムと活性汚泥の細菌群集は、特に成熟した形態のバイオマスにおいて類似していることが判明しました9。しかし、他の研究では、これら 2 つの環境の構造に大きな違いが存在することが示唆されています 10,11。 Jo らによる研究 12 では、特定の細菌グループは両方の形態のバイオマスに共通しているものの、その存在量やコミュニティのメンバー間の相互作用には大きな違いがあることが指摘されており、これは生物多様性の違いに見られます。ネットワークトポロジーの特徴。したがって、これらのマイクロバイオーム、特に廃水処理における代謝の特殊化と、それらの発達と変化する環境条件（曝気戦略など）への対応の違い、およびコミュニティのメンバー間の相互作用の違いについて、より詳細な研究が必要です。。したがって、この研究の目的は、異なる曝気戦略を使用しながら都市廃水を処理するハイブリッド反応器のバイオフィルム内の微生物群集と活性汚泥内の微生物群集との間の構造の違いを特徴付けることであった。研究対象の反応器における有機化合物の変換における特定の細菌種の役割について議論します。この実験は長期間にわたって実施されたため、2 つの形態のバイオマスを研究し、開発のさまざまな段階で比較することができました。我々は、16S rRNA シーケンスと微生物共起ネットワークの分析を組み合わせたアプローチを使用しました。配列決定技術により、バイオフィルムおよび活性汚泥内の群集の微生物組成に関する情報が得られました。この研究の 2 番目の目標は、これらのコミュニティのメンバー間の生態学的関係についての洞察を得ることでした。これには、得られたデータの統計分析と、個々の微生物グループの共起を定量化するための相関行列の作成が必要でした。相関行列に基づいて、最も強く相関する分類群の共起ネットワークが作成されました。このアプローチの利点は、研究対象の環境の分類学的構成が定義されただけでなく、最も頻繁に共存し相互作用する微生物のグループが決定されたことです。したがって、この研究は、廃水処理システムにおける細菌の生態に関する新しい情報を提供し、廃水化合物の変換に関与する細菌間の関係の理解を促進するでしょう。これらの細菌に関する知識を広げることで、廃水処理システムにおける汚染物質除去プロセスをより適切に制御できるようになります。

IFAS-MBSBBR 反応器内で発生するバイオフィルムと活性汚泥の微生物構造を研究するために、573 日間続いた実験中に間隔を置いて合計 15 個のサンプルが採取されました。両方の環境のマイクロバイオームが門および属レベルで説明されました。合計 26 の細菌門と 783 の細菌属が同定されました。生物膜および活性汚泥サンプル中の最も多数の門および属を図 1 および 2 に示します。バイオフィルムと活性汚泥の両方で、最も多くの門はプロテオバクテリアであり、平均存在量はそれぞれ 39.3% ± 9.0 および 40.8% ± 8.2 であり、バクテロイド門門はそれぞれ平均存在量が 14.2% ± 4.9 および 26.1% でした。 ±13.7。さらに、Chloroflexi 門はバイオフィルム中にかなり豊富にありました (平均存在量 13.9 ± 8.1)。一方、放線菌とパテシバクテリウムは活性汚泥中に比較的豊富でした (平均存在量はそれぞれ 9.0% ± 9.6 および 7.5% ± 8.1)。。 STAMP 分析により、バイオフィルム中の Chloroflexi、Acidobacteriota、Nitrospirota と活性汚泥中の Firmicutes の有意な過剰発現が確認されました。

バイオフィルムおよび活性汚泥サンプル全体における最も蔓延する門の相対存在量 (%)。すべてのバイオフィルムおよび活性汚泥サンプル (A) および個々のサンプル (B) の相対存在量の平均値。グラフは、少なくとも 1 つのサンプルで細菌群集全体に 0.5% 以上寄与した門のみを示しています。残りの門の豊富さを合計し、「その他」としてラベル付けしました。

バイオフィルムおよび活性汚泥サンプル全体における最も一般的な属の相対存在量 (%)。すべてのバイオフィルムおよび活性汚泥サンプル (A) および各個別サンプル (B) の相対存在量の平均値。グラフは、少なくとも 1 つのサンプルで細菌群集全体に 1.5% 以上寄与した属のみを示しています。残りの属の豊富さを合計し、「その他」としてラベル付けしました。

どちらの環境でも、さまざまな細菌群の存在量は時間の経過とともに変化しました。バイオフィルムでは、プロテオバクテリアと放線菌の存在量が徐々に減少し、一方、クロロフレキシの存在量が増加しました。活性汚泥では、存在量の変化はより大きく、より急速であり、バクテロイドータの存在量は、反応器運転の 42 日後の 12.7% から 110 日後の 52.3% までの範囲で最も大きく変化し、このときバクテロイドータが優勢な門でした。パテシバクテリアの存在量も大幅に変化しました。その存在量はプロセスの 78 日目、205 日目、および 447 日目に最も高く、それぞれ 20.1%、11.0%、および 7.2% の値に達しました。同様の変化がアルマチモナドタの存在量にも起こり、547日目と573日目には11.4%と7.6%に達しましたが、他の時期に採取されたサンプルでは0.1%を超えませんでした。

属レベルでは、存在量の少ない属（細菌群集全体のそれぞれ < 1.5%）を合わせると、バイオフィルムおよび活性汚泥サンプルのすべてのサンプルで最大のシェアを構成しました（平均存在量はそれぞれ 45.6% ± 5.8 および 30.5% ± 6.0）。）。当初、オルニチニバクターはバイオフィルム中に比較的豊富に存在していました。これが、オルニチニバクターの平均存在量が 4.3% ± 5.3% とかなり大きかった理由です。しかし、時間の経過とともに、このグループの存在量は大幅に減少し、プロセスの終了時点ではわずか 0.3% になりました。同様に、Rhizorhapis の存在量は最初のサンプルでは 13.92% でしたが、その後減少し、205 日目以降はこの属は検出されなくなりました。ニトロスピラとカンジダトゥスコンペティバクターの存在量の変化も注目に値し、最初は増加し、その後減少しています。ニトロスピラは 447 日目のサンプル (5.7%) に最も多く、カンジダトゥスコンペティバクターは 110 日目のサンプル (6.4%) に多く含まれていました。残りの属の存在量は、この研究中のどの時点でも 5% を超えませんでした。

活性汚泥のサンプルでは、オルニチニバクターの存在量も実験の開始時に大幅に減少しました（最初のサンプルの 23.0%、78 日目の 12.5% から、その後の期間では 3% 未満の値に）。一般に、個々の属の存在量は、バイオフィルムよりも活性汚泥の方が急速に変化しました。また、その後の期間、特に未培養のサッカリモナダ目と動物園の場合、多くの細菌群の存在量の急速な減少と増加が見られました。図 3 は、バイオフィルムサンプルと汚泥サンプル間で大きく異なる細菌のグループを示しています。デニトラチソーマ、ニトロスピラ、カンジダトゥスコンペティバクター、デクロロソーマ、カンジダトゥスアキュムリバクター、およびコウレオトリクスは、バイオマスよりもバイオフィルム中に有意に豊富に存在していましたが、ズーグレア、未培養サッカリモナダレス、ロドバクターおよびオットウィアはバイオフィルム中に有意に少なかったです。

微生物門 (A) と属 (B) の平均比率は、バイオフィルム (赤) サンプルと汚泥 (青) サンプル間で大きく異なりました。プロットは、メタゲノムプロファイルの統計分析 (STAMP) ソフトウェアを使用して作成されました。 P 値と信頼区間は、ホワイトのノンパラメトリック t 検定を使用して計算されました。

細菌群集指数は、EZBioCloud プラットフォームを使用して推定されました (表 1)。すべてのサンプルの平均グッドカバレッジは 99.75% ± 0.047% であり、シーケンスカバレッジが非常に高いことを示しています。 OTU の総数はサンプルおよびバイオマスの種類によって異なりました。 OTU の平均数は、バイオフィルムでは 1614 ± 141、活性汚泥では 993 ± 109 でした。 Chao1 指数は群集の豊かさ、つまり生物膜および活性汚泥群集の種の数を評価するために使用され、シャノン指数は種の豊富さと均一性の両方を考慮して群集の多様性を測定するために使用されました。これらの指標の平均値は、バイオフィルム群集が活性汚泥群集よりも豊かで多様であることを示しました (Chao1: 1734.64 ± 138.59 vs. 1105.72 ± 138.59; Shannon: 5.34 ± 0.23 vs. 4.27 ± 0.41)。コミュニティ間の差異はすべて統計的に有意でした (P < 0.05)。

図 4 は、Bray-Curtis の非類似性に基づくベータ多様性分析の結果を示しています。主座標分析により、個々のサンプル間の距離は非常に大きかったが、バイオフィルムと活性汚泥のサンプルが 2 つの別々のクラスターにグループ化されたことが示されました。階層分析により、バイオフィルムと活性汚泥の発達が独立していることが示され、これら 2 種類のバイオマス間の差異の距離が確認されました。

バイオフィルム (B) および汚泥 (S) サンプルの階層的クラスタリングおよび主座標分析プロット。

バイオフィルム内の細菌と活性汚泥の間の相互作用と関係をモデル化するために、共起ネットワーク分析が使用されました。本研究では、バイオフィルムと活性汚泥における属の共起を表す 2 つのネットワークを作成しました。図１〜図４において、図５および図６において、各ノードの色はそのモジュール性クラスパラメータに基づいており、そのサイズはその中間中心性に基づいている。両方のネットワークを特徴付ける基本パラメータを表 S1 に示します。一般に、バイオフィルムネットワークは活性汚泥ネットワークよりもノード間の接続が多く、ノード間の距離もバイオフィルムネットワークの方が小さいことから、バイオフィルムを形成する微生物同士の関係性がより密接であり、関係性が高いことが示されました。どちらのネットワークも同じ数のノード (83) を持っていましたが、バイオフィルムネットワークにはより多くのエッジ (同時発生を象徴するノード間のコネクタ) がありました。どちらのネットワークでも、正の関連付けの数は負の関連付けの数よりわずかに多く、総接続数の 55% を占めています。平均クラスタリング係数 (つまり、ノードとその隣接ノード間のリンクの観察された数と可能な最大数との比) は、活性汚泥よりもバイオフィルムの方が高かった (0.556 対 0.432)。同様に、観察されたエッジの数とそれらの最大可能数との間の比であるネットワーク密度は、バイオフィルムの方が高かった(0.073対0.05)。ネットワークの直径 (最も離れた 2 つのノード間の距離) は、バイオマスよりもバイオフィルムの方が短かった (6 対 7)。同様に、平均経路長 (ノードのペア間の最短経路のエッジの数) は、活性汚泥ネットワークよりもバイオフィルムネットワークの方が短かった (1.984 対 2.241)。平均ノード次数 (ネットワーク内の 1 つのノードと他のノード間のエッジの数) は、活性汚泥ネットワークよりもバイオフィルムネットワークの方が大きかった (6.012 対 4.12)。ノード次数はバイオフィルムネットワークでは 1 ～ 31、活性汚泥ネットワークでは 1 ～ 23 の範囲でした。バイオフィルムネットワークには、ハブノードとみなせる最高次数 (30 以上) の 4 つのノードがありました: Diaphorobacter、Rhizorapis、Mesorhizobium、および Pseudoxanthomonas。これらの微生物は、他の微生物と 61.5% でポジティブな関係があり、38.5% でネガティブな関係がありました。興味深いことに、メソルヒゾビウムおよびシュードキサントモナスの存在量は低かったものの（どのサンプルでも細菌群集全体の 1.5% を超えなかった）、それらは非常に豊富な細菌、たとえばオルニチニバクターと正の関連性を示しました。活性汚泥ネットワークには、ノカルディオイデス、ジェマティモナス、レプトスリックス、リゾラピスの 4 つのハブノード (ノード次数 ≥ 20) もありました。これらのハブノードは、同様の量の正および負のエッジ (それぞれ 51.8% と 48.2%) によって他のノードに接続されていました。作成されたネットワーク内のノードのサイズは、それらの媒介中心性 (他の 2 つのノード間のパス上の特定のノードの出現頻度を示すパラメーター) に比例します。媒介中心性の高い値は、ノードがネットワーク内で中心的な位置にあることを示し、低い値は、ノードが周辺的な位置にあることを示します13。高い媒介中心性を持つ微生物は重要な役割を果たし、ネットワーク内の他の細菌間の架け橋のように機能します。バイオフィルムネットワークでは、パラコッカス、フェオダクティリバクター、およびシュードキサントモナスが媒介中心性の最高値を示しましたが、活性汚泥ネットワークでは、ドンギア、ディアフォロバクター、およびリゾルハピスが最高の値を示しました。

属レベルの分類群または汚染物質除去効率を表すノードと、相関関係を表すエッジ (緑のエッジ - 正の相関、赤のエッジ - 負の相関) を含むバイオフィルムマイクロバイオームのネットワーク。

属レベルの分類群または汚染物質除去効率を表すノードと相関関係を表すエッジ (緑のエッジ - 正の相関、赤のエッジ - 負の相関) を備えた活性汚泥マイクロバイオームのネットワーク。

ネットワークは、汚染物質除去プロセス、つまり有機化合物やリン化合物の除去、脱窒、アンモニア化、硝化などの効率を表す追加のノードを使用して構築されました。バイオフィルムネットワークでは、リン化合物の除去効率と硝化効率が微生物節と最も多くの関連性を示した(それぞれ、9 個が陽性、2 個が陰性、6 個が陽性、4 個が陰性)。リン除去の効率は、カンジダトゥス・アキュムリバクター、デクロロソーマ、タウエラ、および未培養サッカリモナダレの存在量と正の相関があり、一方、硝化はニトロソモナス、スフィンゴモナス、サーモモナスなどの分類群の豊富と正の相関があった。汚染物質除去の残りの効率には、微生物ノードとの関連性がまったくないか、1 ～ 2 つしかありませんでした。対照的に、活性汚泥ネットワークでは、すべての効率ノードが 2 から 9 の範囲の次数で微生物の効率ノードと接続されていました。硝化効率ノードとアンモニア化効率ノードが最も高い次数を持ち、たとえば、ノカルジオイデス、ロドバクター、そしてスフィンゴモナス。有機化合物の除去効率は、Blastocatella、Ornithinibacter、および Terrimonas と正の相関がありましたが、バイオフィルムネットワークではエッジがありませんでした。

Chao1 指数と Shannon 指数を使用して、両方の形態のバイオマスの生物多様性を調べました。すべてのサンプルにおいて、これらの指数の値は両方ともバイオフィルム内で著しく高かった。この発見は、Dong et al.14 が同様の反応器を使用して得た結果と一致しています。しかし、Jo et al.12 は反対の結果を得ており、同様の違いは観察されませんでした。彼らは、この違いの欠如は、群れとバイオフィルムの両方が微生物の凝集から生じるという事実によって引き起こされるのではないかと推測しました。一方、バイオフィルムは層状構造をしており、各層の条件が少し異なるため、異なる細菌群の発生に最適です。これが、本研究において生物膜群集が活性汚泥の群集よりも豊かで多様である理由であると考えられる。

実験中にさまざまな曝気戦略が適用され、反応器内の微生物の増殖に影響を与えました。明らかに、曝気戦略の変更は、生物膜群集よりも活性汚泥細菌群集に強い影響を及ぼした。 PCoA 分析では、最初のサンプルを除いて、バイオフィルムサンプルは活性汚泥サンプルよりも密にクラスター化されていました。この発見は、バイオフィルム群集が活性汚泥群集よりも環境条件の変化に対してより耐性があることを示しています。この変化に対する耐性は、バイオフィルムが複雑な細菌構造であり、微生物によって生成される細胞外ポリマー物質 (EPS) の層に囲まれており、環境ストレスから細菌細胞を保護する物理的障壁として機能するという事実によって説明できます。

どちらのタイプのバイオマスでも、プロテオバクテリアとバクテロイドタが最も豊富な門でした。プロテオバクテリアは通常、都市廃水処理システムの細菌群集で最も豊富なグループです。この分類群には多くのサブグループがあり、その中で最も一般的なのはベータプロテオバクテリアであり、有機物と栄養素の除去に主に関与しています15。バイオフィルム内で次に豊富な門は、Chloroflexi、Actinobacteriota、および Acidobacteriota でした。 Chloroflexi は、微生物構造の形成を促進する糸状細菌です。それらのフィラメントはフロックやバイオフィルムから突き出ており、これによりおそらく周囲の液体中の基質へのアクセスが容易になり9、活性汚泥フロックが形成される足場を提供すると考えられています16、17。放線菌は、プロテオバクテリアおよびバクテロイドータと同様に、廃水処理システムに広く普及している中心門の一部であると報告されています 18,19。 Acidobacteriota はリンの除去に関与しており、グルコース、キシロース、酢酸塩、脂肪酸などのさまざまな有機化合物を利用する可能性があります 20。プロテオバクテリアとバクテロイドタの次に、活性汚泥中に最も豊富な門は、アクチノバクテリオタとパテシバクテリア（特に未培養のサッカリモナダレ）でした。パテシバクテリアは細胞サイズが小さく、ゲノムが減少しているため、これらが宿主依存性の共栄養菌または寄生性であることが示唆されています 21。それらの小さな細胞サイズは、それに応じて表面積対体積比が増加するため、貧栄養環境では有利である可能性があります22。 Zooglea 属はバイオフィルムよりも活性汚泥中に豊富に存在しました。 Zooglea は、活性汚泥フロックの形成に関与するエキソ多糖を生成します23。

ネットワーク分析により、分類群の豊富さと窒素およびリン化合物の除去効率との間の正の関連性が、活性汚泥群集よりもバイオフィルム群集でより一般的であることが明らかになった。これは、バイオフィルムがこれらの化合物を分解できる細菌の増殖にとってより良い環境であることを示している可能性があります。この仮説は、バイオフィルム内に特定の細菌グループが大量に存在することによっても裏付けられています。たとえば、ニトロスピロタ門とニトロスピラ属は両方とも、活性汚泥よりもバイオフィルム中に著しく豊富に存在しました。ニトロスピロタには、亜硝酸塩を硝酸塩（NOB）に酸化する細菌と、硝化プロセスの両方のステップを実行できる最近発見されたコマンモックス細菌（完全なアンモニア酸化剤）が含まれます 24,25。このことは、バイオフィルムにおいてはcommamoxプロセスがアンモニア酸化に重要である可能性があることを示唆している可能性がある。アンモニア酸化細菌（AOB）の代表であるニトロソモナスもバイオフィルム中に豊富に含まれていましたが、ニトロスピラほど多くはありませんでした。この研究の結果は、統合型固定膜活性汚泥シーケンスバッチバイオフィルム反応器 (IFAS-SBR) 内で付着したバイオフィルムと活性汚泥の凝集を比較した Shao らの結果と類似しています 26。ニトロソモナスは、アナモックス細菌 Candidatus Brocadia とも負の関連を示しており、これは同じ基質をめぐる競合によって引き起こされる可能性があります。おそらく、Candidatus Brocadia は、酸素濃度が低いバイオフィルムのより深い層に豊富に存在していたと考えられます。細川ら 27 は、アナモックス細菌がパテシバクテリアと一緒に発生することを報告しましたが、我々の研究では、この分類群が活性汚泥中により豊富に存在しました。おそらくこれは、ハイブリッドシステムにおけるバイオフィルムと活性汚泥の協力の一例である。生物膜には脱窒剤が非常に豊富に含まれていましたが、活性汚泥にも脱窒剤は非常に一般的でした。このグループの微生物のうち、デニトラチソーマ、ロドバクターおよびデクロロソーマはバイオフィルム中に存在し、一方、ロドバクターおよびタウレアは活性汚泥中に存在した。

Bai ら 28 も同様の結果を観察し、バイオフィルムは固体保持時間が長いため、デニトラチソーマ、ロドバクター、デクロロソーマの発生にとっては活性汚泥よりも良い環境であると結論付けました。興味深いことに、これらの著者らは、活性汚泥中により多くのリン蓄積生物（PAO）が存在することも観察しました。これは、例えばPAOの一種であるC.アキュムリバクターが活性汚泥フロック中よりもバイオフィルム中に豊富に存在したという本研究の結果とは異なる。 McIlroy ら 29 は、Candidatus Competibacter もバイオフィルムサンプル中に非常に多数存在すると報告しました。これはグリコーゲンを蓄積する生物であり、PAO と資源をめぐって競合すると考えられています。細菌とさまざまな汚染物質の除去効率との関連性が観察されましたが、細菌と窒素形態の濃度との間には明確な関係はありません。たとえば、ニトロソモナスはアンモニアを酸化するため、ネットワーク内ではニトロソモナスの存在量がアンモニア濃度に反比例し、硝酸塩濃度に正比例することが予想されます。ただし、分析されたネットワークではそのような明らかな依存関係は発生しませんでした。この理由は、テストされたシステムでは、多くの異なる微生物グループによって実行され、個々の形態の窒素の濃度に影響を与えるさまざまなプロセスが発生するためであると考えられます。多くの異なる細菌グループが互いに協力して廃水から窒素化合物を除去し、一種の機能的な全体を形成するため、このプロセスにおける個々のユニットの寄与を判断することは困難です。

ノードの数はバイオフィルムネットワークと活性汚泥ネットワークで同様でしたが、ノード間の相互作用の数はバイオフィルムネットワークの方が多かったです。これらの結果は、バイオフィルム中に存在する属が活性汚泥中に存在する属よりも強い程度に相互作用していることを示しています。分類群の存在量の相関関係は、どちらのタイプのバイオマスでも主に正でした。 Jo らの研究でも、負の相関よりも多くの正の相関が指摘されています 12 が、彼らの研究における正の相関の数 (バイオフィルムネットワークで 92%、活性汚泥ネットワークで 75%) は、私たちの場合は(55%)。それらの中間中心性に基づいて、主要な分類群が両方のネットワークで特定されました。高い媒介中心性を持つ微生物は、他の 2 つのノード間の最短経路上に存在することが多く、このため、コミュニティのメンバー間の情報の流れにとって重要であると考えられています 30。バイオフィルムネットワークにおけるこれらの重要な分類群の 1 つは、リンも除去できる従属栄養性硝化細菌および好気性脱窒細菌であるパラコッカスでした 31。高い媒介中心性を持つ細菌の他のグループには、シュードキサントモナス (好気性条件下で窒素とリンを除去できる 32) およびフェオダクティリバクター (脱窒剤 33) がありました。活性汚泥ネットワークでは、ドンギアとディアフォロバクターが最も高い媒介中心性を持っていました。これらの分類群は窒素の変換に関与しています。化合物27,34. バイオフィルムと活性汚泥ネットワークの違いは、他の細菌がこれら2つの環境における窒素化合物の変換に関与している可能性があることも示しています. ネットワーク分析と上記の分類群の中間中心性の高い値は、存在量の少ない分類群は細菌群集で重要な役割を果たしている可能性がありますが、廃水処理プロセスにおけるこのような細菌の役割はよくわかっておらず、さらなる調査が必要です。

この研究では、バイオフィルムとIFAS-MBSBBRハイブリッド反応器からの活性汚泥の微生物群集の構造を比較しました。バイオフィルムの細菌組成は活性汚泥の細菌組成とは異なりましたが、細菌のいくつかのコアグループ（プロテオバクテリア、バクテロイドータ、アクチノバクテリオタおよびアシドバクテリオタ）は両方のタイプのバイオマスに非常に豊富でした。バイオフィルムは細菌組成の点でより多様であり、硝化菌（ニトロスピラ、ニトロソモナスなど）やリン蓄積微生物（C. アキュムリバクター）の発生に適した環境でした。生物膜ネットワーク内の細菌は、活性汚泥ネットワーク内の細菌よりも相互に多くのつながりを持っていました。さらに、バイオフィルムネットワークでは、より多くの細菌が窒素とリンの除去効率に関与しており、これはバイオフィルムがこれらの汚染物質の除去においてより大きな役割を果たしている可能性があることを示しています。ネットワーク分析では、存在量が少ない細菌でもコミュニティ内で重要な役割を果たしている可能性があることも明らかになりましたが、これらの役割についてはさらなる調査が必要です。これらの分類群の寄与をより深く理解することで、これらの複雑な群集とそれらを作成する細菌間の関係のより完全な全体像が得られるでしょう。

この研究は、有効容量 28 L のシーケンスバッチ反応器の実験室モデルで実施されました。この反応器では、微生物が活性汚泥の形で発生し、EvU-Perl 移動床 (統合固定膜活性汚泥 - 移動床) 上のバイオフィルムが発生します。シーケンスバッチバイオフィルムリアクター—IFAS-MBSBBR)。直径 Φ5 mm、h = 8 mm、比表面積 600 m2/m3 の円筒形担体は、反応器の有効容積の 25% を構成しました。活性汚泥の濃度は約 1.7 g MLSS/L のレベルに維持されました。 IFAS-MBSBBR の操作は完全に自動化され、DreamSpark Premium ソフトウェア (SCADA システム) によって制御されました。廃水を蠕動ポンプIsmatec Ecolineにより反応器に供給し、その内容物を低速パドルミキサーCAT R-50Dで撹拌した。酸素濃度は、送信機 Liguiline CM 442 と連携する光学プローブ Oxymax COS61D によって測定されました。システムは空調された部屋で動作し、反応器内の温度が 20°C であることを保証しました。

反応器には、都市廃水の組成をシミュレートした合成廃水が供給されました。以下の廃水特性が仮定されました: COD 510 mg O2/L、TN 60 mg N/L、N-NH4+ 40 mg N-NH4+/L、P-PO43- 8 mg P-PO43-/L、pH 7.7。それらの調製には、ペプトン (135 mg/L)、デンプン (45 mg/L)、グルコース (45 mg/L)、グリセリン (0.0495 ml/L)、酢酸アンモニウム (225 mg/L)、NaHCO3 (125 mg/L) が使用されました。 )、Na2HPO4 (15 mg/L)、および KH2PO4 (4.5 mg/L)。

反応器は、1 日あたり 3 回の 8 時間サイクルのシステムで運転されました。単一の処理サイクルには次のフェーズが含まれます: I フェーズ (曝気なしで廃水投与あり) (50 分)、I フェーズあり (190 分)、I フェーズあり (190 分)、II フェーズなし (30 分)、II 好気フェーズ (150 分)、沈降（50分）、デカンテーション（10分）。 573 日間の実験期間中、断続的な曝気戦略を得るために送風機ユニットをオフにする期間を好気段階に導入するか、酸素濃度を変更しました。さらに、447 日目と 547 日目の研究日の間で、廃水量が 10 L/日から 6.6 L/日に減少することにより、原子炉の汚染負荷が減少しました (表 2)。流入水と流出水のサンプルは、2018 年 12 月から 2020 年 6 月の間に収集されました。化学分析は標準的な方法に従って実行されました (表 S2)。

微生物検査用のバイオマスサンプルは、2018年12月から2020年6月まで指定された間隔でバイオフィルムおよび活性汚泥から収集されました。サンプルは-25℃で保管されました。FastDNAを使用して200 ngのバイオマス（活性汚泥とバイオフィルムの両方）からDNAが単離されました™ 土壌用 SPIN キット (MP Biomedicals、米国)。単離手順は製造元の指示に従って実行されました。 Qubit 蛍光光度計 (Invitrogen、米国) を使用して、単離された DNA の量を測定しました。得られた DNA は、さらなる分析まで -18 °C で保存されました。

16S rRNA 遺伝子の V3-V4 領域をターゲットとするハイスループットのイルミナシークエンシングは、Sd-Bact-0341-bS-17 および Sd-Bact-0785-aA-21 プライマー 35 と NEBNext®High-Fidelity 2X PCR Master Mix ( Bio Labs inc.、米国）製造元のマニュアルに従ってください。シーケンス反応は、MiSeq シーケンサーおよび MiSeq 試薬キット V2 (Illumina、米国) を使用し、メーカーのプロトコールに従い、リード長 2 × 250 bp のペアエンド技術を適用して実行しました。

生のペアエンド配列は、QIIMEII36 ソフトウェアパッケージを使用して処理されました。ペアエンド配列は、高速結合アルゴリズムを使用してマージされました。ソフトウェアがマージできなかった読み取りは、さらなる分析から除外されました。フィルタリングプロセスの品質スコア (q < 20) は、Cutadapt アルゴリズム 37 を使用して取得されました。キメラ配列は、USEARCH38.16S rRNA を使用して検出され、分析から除外されました。SILVA_V_138 データベースに対するクローズドリファレンス OTU 選択プロトコルを使用して、Illumina リードから OTU が選択されました 39。配列は 97% の同一性でクラスター化され、配列決定プライマーに隣接する 16S rRNA V4 領域のみに及ぶようにトリミングされました。分類の割り当ては、各 OTU を定義する SILVA_V_138 参照配列に関連付けられた分類に基づいて OTU に関連付けられました。

バイオフィルムと活性汚泥サンプルの統計的比較は、STAMP ソフトウェア (メタゲノミクスプロファイルの統計分析 (http://kiwi.cs.dal.ca/Software/STAMP)) を使用して行われました。 40. 有意性は、White のノンパラメトリック t 検定で決定されました。。 P < 0.05 の結果は有意であるとみなされました。

細菌の共起ネットワークは、分類学的プロファイルの相関分析に基づいて作成されました41。分析のために、研究されたメタゲノムの中で最も豊富な分類群が選択されました。スピアマン相関分析（α = 0.05 の有意性閾値）は、STATISTICA v.13.1 (StatSoft, Inc、米国オクラホマ州タルサ) を使用して実行されました。ネットワークは、相関の強い分類群 (相関係数が 0.75 より高い、または -0.75 より低い) についてのみプロットされました。このようにして得られた相関行列は、Gephi ソフトウェア 42 を使用してネットワークを作成するために使用されました。アルファおよびベータ多様性分析は、EZBioCloud プラットフォーム 43 を使用して実行されました。

配列リードは、アクセッション番号 PRJNA793374 で NCBI Sequence Read Archive (SRA) に寄託されました。

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この研究は、ポーランド国立科学センター No. UMO-2017/27/B/NZ9/01039 の資金提供を受けました。

環境バイオテクノロジー学部、ワルミア・マズリ大学、オルシュティン、Sloneczna 45G、10-709、オルシュティン、ポーランド

マルティナ・ゴジエバ & スワヴォミール・チェシエルスキ

給水および廃水処理学科、建築サービス学部、水力および環境工学、ワルシャワ工科大学、Nowowiejska 20、00-653、ワルシャワ、ポーランド

モニカ・ズブロフスカ・スドル & ジャスティナ・ワルチャック

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MG: 概念化、調査、形式分析、視覚化、執筆 - 原案。 MZ-S.: 概念化、方法論、執筆 - レビューと編集、JW: 調査、執筆 - レビューと編集。 SC: 概念化、方法論、監督、執筆 - レビューと編集。

対応者はマルティナ・ゴジーバです。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Godzieba, M.、Zubrowska-Sudol, M.、Walczak, J. 他ハイブリッド反応器におけるバイオフィルムおよび活性汚泥における微生物群集の発達。 Sci Rep 12、12558 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-16570-z

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受信日: 2022 年 4 月 25 日

受理日: 2022 年 7 月 12 日

公開日: 2022 年 7 月 22 日

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国際環境科学技術ジャーナル (2022)

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