サブユニットの構築

Scientific Reports volume 6、記事番号: 19183 (2016) この記事を引用

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4 オルトメトリック

メトリクスの詳細

メタロシャペロンは、適切な金属を標的タンパク質に送達するように設計された金属結合タンパク質です。 金属は通常、異なるタンパク質間を移動します。 この研究では、変異型ニトリルヒドラターゼ (NHase) の同じサブユニット間で金属が移動することを発見しました。 さまざまな「活性化タンパク質」が、NHase への金属イオンの輸送を仲介します。 我々は、シュードモナス・プチダ由来のNHaseのβ-およびα-サブユニットおよび/または「活性化タンパク質」を融合することによって融合NHaseを構築しました。 融合 NHase は、より高い熱安定性と高濃度の生成物アミドに対する耐性を示しました。 コバルト取り込みのメカニズムは、インビボでは自己サブユニット交換パターンからアポタンパク質特異的分子シャペロンパターン、インビトロではメタロシャペロンパターンに変化した。 注目すべきことに、コバルトの移動はメタロシャペロンパターンの同じαサブユニット間で起こった。 これらの結果は、融合型NHaseの優位性を実証しただけでなく、金属タンパク質生合成における革新的な金属イオン移動パターンも明らかにした。

金属タンパク質は数十年にわたって集中的に特性評価されており、全タンパク質の 3 分の 1 以上が金属タンパク質です1。 タンパク質内で金属イオンが媒介する役割には、電子伝達、酸素輸送、遺伝子調節、構造安定化などがあります2。 金属中心生合成のいくつかの一般的なメカニズムがレビューで報告されています 3。 そのうちの 1 つは、金属イオンまたは金属含有分子のメタロシャペロン送達です。 メタロシャペロンは、適切な金属イオンまたは金属含有分子を標的タンパク質に送達するように設計された金属結合タンパク質です。 標的タンパク質とメタロシャペロンは通常異なるタンパク質であり、標的タンパク質はリガンド特異性を示し、金属イオンに対してより高い親和性を示します。

ニトリルヒドラターゼ (NHase、EC 4.2.1.84)4 は、広範囲のニトリルから対応するアミドへの水和を触媒する酵素です。 この酵素は α サブユニットと β サブユニットで構成され、非ヘム鉄 (Fe-NHase)6 または非コリン コバルト (Co-NHase)7,8 のいずれかを含んでいます。 NHase への金属イオンの輸送は、対応する「活性化タンパク質」によって媒介されます9。 Fe-NHase のアクチベーターはメタロシャペロンとして作用することが示されています 10 が、「アクチベータータンパク質」はほとんどの Co-NHase へのコバルト取り込みのための「自己サブユニット交換シャペロン」として作用します 9、11、12。

自己サブユニット交換は、Co-NHase ファミリーの翻訳後成熟ステップの 1 つです11。 アクチベータータンパク質は NHase の α サブユニットとの複合体として存在し、NHase へのコバルトの取り込みは、コバルトを含まない NHase α サブユニットと複合体のコバルト含有 α サブユニット間の α サブユニットの交換に依存します9。 自己サブユニット交換は、Kuchar と Hausinger による総説で報告されている現在知られている金属中心生合成の一般的な機構 9、11、13 とは次のようにまったく異なります。 (ii) 金属イオンまたは補因子のメタロシャペロン送達。 (iii) 金属結合部位を作成する翻訳後修飾。 (iv) 金属と別の成分との相乗的結合。 (v) 金属含有補因子の合成。 (vi) 電子移動を伴う金属の取り込み。 (vii) アポタンパク質特異的分子シャペロンの必要性など14。 自己サブユニット交換は、ロドコッカス ロドクロス J19 の L-NHase で最初に発見され、続いて同じ株の H-NHase で発見され 11、他のさまざまな Co-NHase および NHase ファミリー酵素であるチオシアン酸加水分解酵素でも起こると推測されています。また、2 つの翻訳後修飾されたシステイン リガンドを備えたユニークな非コリン コバルト中心も含まれています 12,15。 「自己サブユニット交換シャペロン」は、金属中心生合成におけるメタロシャペロンやタンパク質のフォールディングにおける分子シャペロンとは対照的に、驚くべきタンパク質機能を示します9,11。

NHase は、高純度のアクリルアミドやニコチンアミドの工業生産に広く使用されています4。 ただし、活性の高い NHase のほとんどは、産業用途では不安定です 16。 例えば、シュードモナス・クロロラフィルスＢ２３およびロドコッカス種のＮＨａｓｅは、 N-774 は 20 °C 以下で安定です 17,18 が、ロドコッカス ロドクロス J1 の NHase は 10 ～ 30 °C の間でのみ安定です 19。 ニトリルの水和反応は発熱反応であるため、冷却によって NHase を安定化させるために低い反応温度を維持する必要があり、これにより通常、莫大な余分なエネルギーコストが発生します 16。 さらに、工業的製造においては、高濃度の製品アミドに対する耐性が必要です。 したがって、工業的製造には、高活性および高耐性を備えた、より安定なNHaseが必要です。

サブユニット遺伝子融合はタンパク質の安定性を高めることができます20、21、22。 遺伝子融合は、以前は異なっていた 2 つ以上の遺伝子を単一のオープン リーディング フレームに融合させる戦略です。 さらに、融合イベントはタンパク質の複雑なトポロジーを単純化することでアセンブリを最適化する傾向があることが報告されています23。 最近、真核生物モノシガ ブレビコリスの NHase の新しい遺伝子構造が予測されました 24。 この NHase では、通常は分離されている 2 つの NHase サブユニット (β および α サブユニット) が 1 つのペプチドに融合されています。 融合 NHase は、より高い活性、より高い安定性、または新しい基質特異性などの有益な特徴を有すると予測されています 24。 したがって、遺伝子融合戦略は、NHase の応用を改善するための効果的なツールとなる可能性があります。

この研究では、シュードモナス プチダ NRRL-18668 (P. putida) の NHase の β サブユニットと α サブユニットを融合することにより、1 つのポリペプチドのみを含む新しいタイプの NHase を構築しました。 融合 NHase は、野生型よりも大幅に高い熱安定性と生成物耐性を示しました。 活性化タンパク質 P14K も融合 NHase の活性化に必要でした。 さらに、P14K はさらに β および α サブユニット融合 NHase と融合され、別の融合 NHase が形成されました。 これらの構造変化により、NHase のコバルト取り込み機構が変化しました。 複合体 α(P14K)2 (2 つの P14K がαサブユニットと結合したもの) は、インビトロでコバルトイオンを融合 NHase に移動させるメタロシャペロンとしての役割を果たしました。 コバルトの移動は、コバルトを含まないNHase (apo-NHase) と複合体α(P14K)2の間の同じαサブユニット内で起こり、金属タンパク質生合成における革新的な金属イオン移動パターンが明らかになりました。 さらに、P14K は、生体内でのコバルト取り込みのためのアポタンパク質特異的分子シャペロンとして機能する可能性が最も高くなります。

P.プチダ由来のNHaseは以前に構築され、大腸菌BL2125で正常に過剰発現されました。 Monosiga brevicollis の遺伝子構造に基づいて、サブユニット遺伝子融合を持つ 2 つの変異型 NHase を構築しました。 以前は区別されていた β サブユニット遺伝子と α サブユニット遺伝子 (B 遺伝子と A 遺伝子) が、リンカー (ジペプチド、プロリン-グリシン) で 1 つの遺伝子 (BA) に融合されました。 融合遺伝子（BA）はプラスミドpET28aに挿入され、pET28a-（BA）が得られました（図1a）。 次に、アクチベーター遺伝子 P14K を変異遺伝子 (BA) の下流に挿入し、pET28a-(BA)P14K を生成しました。 pET28a-(BA)およびpET28a-(BA)P14Kを有する形質転換体を使用してNHaseを発現させた。 その結果、NHase活性が検出され、形質転換体の対応するタンパク質バンドのそれぞれがSDS-PAGE上で明らかであり、2つの融合NHaseが首尾よく発現されたことが示されました（図1b）。 以下、遺伝子(BA)および(BA)P14Kによってコードされる融合NHaseを、それぞれNHase-(BA)およびNHase-(BA)P14Kと称する。

組換えNHaseの構築、発現および精製。

(a) プラスミドのセットを構築するための遺伝子構成。 (b) 各形質転換体の無細胞抽出物の SDS-PAGE。 1、マーカー。 2、野生型NHase。 3、NHase-(BA); 4、NHase-(BA)P14K。 5、NHase-(BAP14K)。 (c) 精製酵素の SDS-PAGE。 1、マーカー。 2、野生型NHase。 3、NHase-(BA); 4、NHase-(BA)P14K。 5、NHase-(BAP14K)。

NHase-(BA) および NHase-(BA)P14K を精製して特性評価し (図 1c)、野生型 NHase と比較しました。 表1に示すように、NHase-(BA)P14Kの比活性およびkcatは野生型NHaseよりも高く、βサブユニットとαサブユニットの融合によって活性が増加することが示されました。 NHase-(BA) のコバルト含有量は NHase-(BA)P14K の約 14% であり、融合 NHase であってもコバルトの取り込みには P14K も必要であることが示されました (表 1)。 NHase-(BA) および NHase-(BA)P14K のミカエリス定数 (Km 値) は両方とも野生型 NHase のミカエリス定数 (Km 値) よりも高く (約 1.5 倍)、これは β サブユニットと α サブユニットの融合が示唆されています。基質が活性中心に結合するプロセスを制限する可能性があります。 NHase-(BA)P14KのMALDI-TOF質量分析により、NHase-(BA)P14Kがβαの全長であることが示されました（図S1）。 野生型 NHase は四量体 (α2β2) です。 融合酵素の分子量はゲル濾過クロマトグラフィーによって測定されました。 NHase-(BA) および NHase-(BA)P14K の分子量は、それぞれ 97.8 kDa および 85.1 kDa でした (図 2)。 融合 βα の分子量の計算値は 49.2 kDa であるため、融合 NHase は両方とも二量体 [(βα)2] であるはずです。 遠紫外円二色性（CD）スペクトル解析を用いて、野生型NHase、NHase-(BA)、NHase-(BA)P14Kの各特性を詳細に比較しました。 NHase-(BA) および NHase-(BA)P14K のスペクトルは両方とも野生型 NHase のスペクトルとは異なっており (図 3a)、これは NHase-(BA) または NHase-(BA)P14K の二次構造が異なることを示しています。は野生型 NHase とは異なります。

融合NHaseの分子量と構造の決定。

ゲル濾過に使用されるマーカータンパク質：（i）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（酵母）（290 kDa）。 (ii) 乳酸デヒドロゲナーゼ (ブタ心臓) (142 kDa)。 (iii) エノラーゼ (酵母) (67 kDa); (iv) ミオキナーゼ (酵母) (32 kDa)。 (v) シトクロム c (馬の心臓) (12.4 kDa)。

野生型NHaseおよび融合NHaseの遠紫外CD（a）およびUV-Vis吸収スペクトル（b〜d）。

P14K は、野生型 NHase および融合 NHase へのコバルトの組み込みに必要でした。 我々は、P14KをNHase-(BA)の(βα)-カルボキシル末端にさらに融合させた、3サブユニット融合タンパク質遺伝子(BAP14K)の構築を試みた。 融合遺伝子（BAP14K）をプラスミドpET28aに挿入し、pET28a-(BAP14K)を生じた（図1a）。 pET28a-(BAP14K)を保有する形質転換体をNHase発現に使用した。 その結果、変異型NHaseの対応するタンパク質バンドがSDS-PAGE上で検出され（図1b）、融合NHaseが正常に発現されたことが示されました。 以下、当該遺伝子（BAP14K）がコードする融合NHaseをNHase-(BAP14K)と称する。 NHase-(BAP14K) を精製し、特性評価しました (図 1c)。 表1に示すように、NHase-(BAP14K)の比活性およびkcatは野生型NHaseよりも高く、NHase-(BAP14K)とNHase-(BA)P14Kの間の比活性およびkcatの差は小さかった。 。 野生型 NHase および NHase-(BA)P14K と比較して、NHase-(BAP14K) の Km 値が最も高く、P14K の融合により基質結合がさらに制限されたことが示されました。 NHase-(BAP14K)の分子量は、ゲル濾過クロマトグラフィーによって測定されました。 NHase-(BAP14K) の分子量は 150.6 kDa でした。 融合体 βαP14K の分子量の計算値は 67.0 kDa であるため、NHase-(BAP14K) は二量体 [(βαP14K)2] であるはずです (図 2)。 NHase-(BAP14K)のCDスペクトルはNHase-(BA)P14KのCDスペクトルと類似しており(図3a)、NHase-(BAP14K)の二次構造がNHase-(BA)の二次構造と類似していることを示しています。 )P14K ですが、野生型とは異なります。

NHase-(BAP14K) は野生型よりも高い NHase 活性を示したので、融合 NHase 活性に対する P14K の位置の影響を研究しました。 さらに 2 つの 3 サブユニット融合 NHase 遺伝子 (BP14KA) および (P14KBA) を設計しました。 (BP14KA) では、P14K 遺伝子は β サブユニット遺伝子と α サブユニット遺伝子の間に位置していました。 （P14KBA）では、P14K遺伝子が（βα）サブユニット遺伝子よりも前にありました（図1a）。 ｐＥＴ２８ａ－（ＢＰ１４ＫＡ）およびｐＥＴ２８ａ－（Ｐ１４ＫＢＡ）を保有する形質転換体を使用して、それぞれＮＨａｓｅ－（ＢＰ１４ＫＡ）およびＮＨａｓｅ－（Ｐ１４ＫＢＡ）を発現させた。 融合NHaseを精製し、アッセイしました。 NHase-(BP14KA) の活性は 148.6 U/mg で、NHase-(BAP14K) の活性 (452.5 U/mg) の約 32% でした。 NHase-(P14KBA)の活性は76.7 U/mgで、NHase-(BAP14K)の活性の約17%でした。 これらの発見は、P14K の位置が融合 NHase 活性に大きく影響することを実証しました。 P14Kが(βα)-カルボキシル末端の下流に位置する場合、融合NHaseは最も高い活性を示した。

NHase-(BA)P14K および NHase-(BAP14K) の比活性および kcat は、野生型 NHase よりも高かった。 したがって、熱安定性と製品耐性の観点からさらに比較しました。 酵素を10 mM リン酸カリウム緩衝液（KPB）（pH 7.5、0.5 mM ジチオスレイトールを含む）中で50℃でインキュベートし、各NHaseの活性を10分ごとに測定しました。 図4aに示すように、NHase-(BA)P14KとNHase-(BAP14K)の半減期は両方とも野生型よりもそれぞれ2.8倍と2倍長く、NHase-(BA)P14KとNHaseが-(BAP14K)は野生型NHaseよりも高い熱安定性を示します。

融合NHaseと野生型NHaseの特性比較。

(a) 融合 NHase と野生型 NHase の熱安定性、(b) 製品耐性、および (c) 至適 pH の分析。

熱安定性に加えて、生成物の高度な蓄積は大規模工業生産にとって有益であり、エネルギーの節約と下流プロセスの簡素化につながります19。 野生型酵素と融合酵素の高濃度アミドの耐性を比較するために、ニコチンアミドを使用して NHase の生成物耐性をテストしました。 反応は、２０ｍＭの３−シアノピリジン（基質）中で、０．５Ｍのニコチンアミド（生成物）の存在下および非存在下で１０分間実施した。 各反応における 3-シアノピリジンの減少を測定し (図 4b)、減少率 (0.5 M ニコチンアミドを使用した場合と使用しない場合の反応で減少した 3-シアノピリジン量の割合) を計算しました。 NHase-(BA)P14K および NHase-(BAP14K) の減少率はそれぞれ 0.86 および 0.83 であり、野生型 (0.80) よりも高く、融合 NHase が野生型よりも高い生成物耐性を示したことが示されました。タイプ。

ほとんどの NHase の生理学的に最適な pH 値は 6.5 ～ 8.5 の間で変動し、P. putida 由来の NHase は pH 7.2 ～ 7.826 の間で幅広い活性最大値を示します。 融合NHaseの最適pHを測定し、野生型と比較しました。 図4cに示すように、野生型、NHase-(BA)P14KおよびNHase-(BAP14K)の最適pHは、それぞれ7.5、8.0、および7.5でした。 NHase-(BAP14K) は野生型と同様の安定範囲を示しましたが、NHase-(BA)P14K の安定範囲はより広く、6.5 から 9.0 でした。このことは、この融合が NHase の適切な pH 範囲を広げる可能性があることを示唆しています。 。

P14K は、P. putida の NHase へのコバルトの組み込みに必要です12。 P14K は、NHase の α サブユニットと複合体 α(P14K)2 を形成します。 NHase へのコバルトの取り込みは、コバルト含有 α(P14K)2 と apo-NHase の間の α サブユニット置換に依存しており、機能的な NHase12 が形成されることが確認されています。 P14K は、融合 NHase へのコバルトの組み込みにも必要でした (表 1)。 ここでは、α(P14K)2 が融合 NHase を活性化できるかどうかを研究しました。 精製されたコバルト含有α(P14K)2 は、前述のように P14K の前に Strep タグを追加することによって得られました 12 (図 1a)。 コバルトを含まない融合NHase [apo-NHase-(BA)、apo-NHase-(BA)P14K、およびapo-NHase-(BAP14K)]を、コバルトの非存在下で培養物から精製しました。 アポ野生型NHaseも精製し、対照として使用しました。 精製したapo-野生型NHase、apo-NHase-(BA)、apo-NHase-(BA)P14K、およびapo-NHase-(BAP14K)をそれぞれ精製コバルト含有α(P14K)2と混合し、インキュベートしました。 。 インキュベーション時間が増加するにつれて、すべての混合物中の NHase 活性が増加し、融合 NHase の最も高い活性が 1 時間で観察されました。 次いで、得られた各NHase [R-野生型NHase、R-NHase-(BA)、R-NHase-(BA)P14KおよびR-NHase-(BAP14K)]を混合物から精製し、アッセイした。 R 野生型 NHase の NHase 活性は野生型 NHase の活性と類似しており、これは以前に報告された自己サブユニット交換の原理と一致しています 12。 興味深いことに、R-NHase-(BA)P14K および R-NHase-(BAP14K) の NHase 活性はそれぞれ 240.5 および 219.2 U/mg であり、対応するコバルト含有融合 NHase の約 50% でした。 R-NHase-(BA) も、コバルト含有融合 NHase の 30% の活性 (147.2 U/mg) を示しました (表 1)。

コバルトイオンはNHase活性に必要です。 融合 apo-NHase は α(P14K)2 によって活性化されました。 これらの結果は、コバルトイオンがα(P14K)2 から融合アポNHase に移動したことを示しています。 α(P14K)2 と融合 apo-NHase の間のコバルト移動を確認するために、UV-Vis 吸収スペクトル分析を実行しました。 図3に示すように、得られた酵素はすべて、NHase（コバルト含有NHase）（図3c）のものと同様の300〜350 nm領域（図3b）に余分なショルダーを示しました。余分なショルダーはapo-NHaseでは検出されませんでした（図3d）。 これらの発見は、R-NHase-(BA)、R-NHase-(BA)P14K、および R-NHase-(BAP14K) がコバルト含有酵素であることを示唆しました。 表 1 に示すように、コバルト含有量を測定しました。R-NHase-(BA)、R-NHase-(BA)P14K、および R-NHase-(BAP14K) にはそれぞれ 0.23 mol イオン/mol (βα)、0.61 mol イオンが含まれていました。 /mol (βα) および 0.62 mol イオン/mol (βαP14K)。 逆に、apo-NHase、apo-NHase-(BA)、apo-NHase-(BA)P14K、および apo-NHase-(BAP14K) をコバルトイオンと混合し、インキュベートしました。 これらの混合物では有意な活性は検出されず（データは示さず）、これは、P14Kのフラグメントを含むapo-NHase-(BAP14K)であっても、融合NHaseがインビトロでコバルトイオンと混合しても活性化できないことを示している。

金属イオンの結合は、NHase3,26 の α サブユニットにある 2 つのシステインの翻訳後修飾に関与しています。 しかし、そのような修飾は apo-NHase26 では観察できませんでした。 これらの結果により、システイン残基はコバルト含有融合NHaseでは修飾されているが、apo-NHaseでは修飾されていないと推測することができました。 コバルト挿入前後の活性部位のシステイン酸化状態を明らかにするために、apo-NHase-(BA)P14K、apo-NHase-(BAP14K)、R-NHase-(BA)P14K、R-NHase-(BAP14K)を分析しました。 NanoLC-ESI-MS/MSによる。 酵素は、還元およびカルボキサミドメチル化後にトリプシンで処理されました。 すべての金属リガンド残基を含むトリプシン加水分解ペプチド V351CTLCSCYPWPTLGLPPAWYK371 (VK21) の分子量を測定しました。 apo-NHase-(BA)P14K および apo-NHase-(BAP14K) のトリプシン消化物の質量スペクトル (図 5a、c、内側) では、m/z 1286.15 および 1285.95 の質量ピークがそれぞれ対応することがわかりました。 3 つのカルボキサミドメチル (CAM-) システインを含む VK21 の [M+2H]2+ イオンの m/z 値に換算します (計算された m/z 値は 1285.94 でした)。 ただし、R-NHase-(BA)P14K および R-NHase-(BAP14K) のトリプシン消化物の質量スペクトル (図 5b、d、内側) では、最も多くの質量ピークが m/z 1272.83 および 1272.83 であることがわかりました。 １２７２．８２はそれぞれ、Ｃｙｓ−ＳＯ２Ｈおよび２つのＣＡＭ−システインを有するＶＫ２１の［Ｍ＋２Ｈ］２＋イオンのｍ／ｚ値に対応する（計算されたｍ／ｚ値は１２７３．４４であった）。 修飾された残基を特定するために、m/z 1286.15、1272.83、1285.95、および 1272.82 のイオンの MS/MS シーケンスを実行しました。 スペクトルは、R-NHase-(BA)P14K および R-NHase-(BAP14K) の Cys355-SO2H、および apo-NHase-(BA)P14K および apo-NHase-(BA)P14K および apo- NHase-(BAP14K)。 Cys-SOH 修飾の発生は化学的に不安定であるため確認されていません 27 が、これらの結果は、コバルト挿入後の 2 つの融合 NHase に酸化されたシステイン残基が存在することを強く示唆しています。

MS/MS 分析による Cys355-SO2H の同定。

(a) apo-NHase-(BA)P14K、(b) R-NHase-(BA)P14K、(c) apo-NHase-(BAP14K)、(d) R-の VK21 ペプチドに対応する各二重荷電イオンNHase-(BAP14K) は、NanoLC-ESI-MS/MS システムによって分析されました。 3 つの CAM システインを含む VK21 ペプチドの [M+2H]2+ イオンに対応する m/z 1286.15 および 1285.95 の質量ピーク (計算された m/z 値は 1285.94) が (a、c) の内側に示されています。 m/z 1272.83、1272.82 の質量ピークは、Cys-SO2H および 2 つの CAM-システインを含む VK21 ペプチドの [M+2H]2+ イオンに対応します (計算された m/z 値は 1273.44)。b の内側に示されています。 d. ペプチド結合における N 末端フラグメント イオンと C 末端フラグメント イオンは、図ではそれぞれ b と y としてラベル付けされています。 b5 および b4 イオンは、R-NHase-(BA)P14K および R-NHase-(BAP14K) では Cys355 がスルフィン酸に酸化されたが、apo-NHase-(BA)P14K および apo-NHase-( BAP14K）。 b*は脱アミノ化後のb型イオンを意味し、y*は脱アミノ化後のy型イオンを意味します。

P.プチダのNHaseへのコバルトの取り込みは、apo-NHaseのコバルトを含まないαサブユニットとα(P14K)のコバルト含有αサブユニットとの間のαサブユニットの交換に依存していることが確認されている212。 (図6a)。 融合NHaseの場合、融合NHaseの活性化にはP14Kも必要であり、インビトロでコバルトイオンがα(P14K)2から融合NHaseに移動することが判明した(表1)。 融合NHaseではαサブユニットが1つのポリペプチドとしてβサブユニットと融合しているため、融合NHaseとα(P14K)2の間でαサブユニットの交換が起こる可能性は低い。 したがって、α(P14K)2 のαサブユニット内のコバルトイオンは、融合NHaseのαサブユニットドメインに直接転移された可能性があります。 この過程において、α(P14K)2 はおそらくコバルトイオン移動のためのメタロシャペロンとして機能したと考えられる。 コバルトイオンは、同じ 2 つの α サブユニット間で移動しました。

融合NHaseへのコバルト取り込みの提案されたメカニズム。

(a) 野生型 NHase へのコバルト組み込みのための自己サブユニット交換。 (b) in vitroでのα(P14K)2からapo-NHase-(BA)P14Kへのコバルト転移。 apo-NHase-(BA)P14K のアポ α サブユニットは、自己サブユニット交換中に P14K の認識 (結合) 部位に接近して結合し 11、次に (apo-NHase-(BA)P14K) の β サブユニットと結合します。コバルト含有αサブユニット（α(P14K)2）は静電相互作用によって引き付けられ、互いに会合して中間複合体を形成します。 2 つのタンパク質間の α サブユニット交換の代わりに、コバルトイオンの直接移動が起こります。 2 つのシステインの酸化はコバルト結合の原因となり、その結果、活性型 NHase-(BA)P14K が生じます。 (c) in vivoでの融合apo-NHase-(BA)P14Kへのコバルトの取り込み。 P14K は、融合 βα タンパク質の α サブユニット ドメインと直接接触します。これは、α サブユニット内の結合部位が融合によって遊離し、コバルト挿入と 2 つのシステイン酸化のための中間複合体が生じるためです。 これらのモデルでは、1 つの融合 βα タンパク質を使用して apo-NHase-(BA)P14K を示し、2 つのアルギニンの位置の変化を使用してコバルト取り込み後のさらなる折り畳みを示します。

Fe-NHase と Co-NHase の両方の金属イオンは、α サブユニットに位置し、2 つの酸化システイン残基を含む特徴的な金属結合モチーフ (CXLC(SO2H)SC(SOH)) を共有します: システイン - スルフィン酸 (Cys-SO2H) ) およびシステインスルフェン酸 (Cys-SOH)4,28,29,30。 酸化されたシステイン残基は NHase 活性に必須であり 9,31、融合 NHase の 2 つのシステイン残基が酸化される必要があることを示しています。 対応する 2 つの酸化システイン残基が αe2 (R. rhodochrous J1 の L-NHase の自己サブユニット交換に使用される複合体) の α サブユニットに存在することが判明しており、α(P14K) の 2 つのシステイン残基が存在することを示唆しています。 2は酸化する必要があります。 メタロシャペロンは、適切な金属イオンまたは金属補因子を高度に特異的な標的に送達するように設計された金属結合タンパク質です3。 金属イオンまたは金属補因子は、通常、2 つの異なるタンパク質間で移動され、その移動は、銅イオンを ATPase およびスーパーオキシドジスムターゼに移動させる銅メタロシャペロンなど、金属イオンまたは金属補因子に対するリガンドの特異性と親和性に依存します32、33、34、35。およびニッケルイオンをウレアーゼおよびヒドロゲナーゼに転移するニッケルメタロシャペロン36、37、38。 これらのプロセスにおいて、銅メタロシャペロンはATPアーゼやスーパーオキシドジスムターゼとは全く異なり、ニッケルメタロシャペロンはウレアーゼやヒドロゲナーゼとは全く異なり、標的タンパク質はメタロシャペロンよりも高いリガンド特異性と親和性を示すはずです。 ただし、α(P14K)2 と NHase は 2 つの異なるタンパク質ですが、α(P14K)2 と融合 NHase の α サブユニットは同じアミノ酸配列を持ち、同じコバルト イオン リガンドを持つはずです。 したがって、我々は、異なるタンパク質複合体の同じタンパク質サブユニット間で金属イオンが輸送される、金属タンパク質生合成の金属イオン輸送パターンを発見しました。

同じタンパク質内で同じリガンド環境でコバルトイオンが移動するのは不思議です。 この現象は、NHase の活性部位の構造に関連している可能性があります。 翻訳後酸化された Cys-SO2H および Cys-SOH は、それぞれ脱プロトン化された Cys-SO2- および Cys-SO- 構造を持ち、α サブユニット内の脱プロトン化された Cys-SO2- および Cys-SO- は、次の 2 つのアルギニンと塩橋を形成します。 NHase の β サブユニット (図 S2)9。 自己サブユニット交換を引き起こす塩には静電気力のみが必要です9。 P14K は β サブユニットより短く、対応するアルギニンを欠いているため、対応する塩橋は α(P14K)2 には存在しないはずです (図 S3)。 塩橋はおそらくコバルトイオンの配位子環境に影響を与え、その結果コバルトイオンに対する親和性が高くなったと考えられます。 したがって、α(P14K)2が融合NHaseと混合されると、コバルトイオンがα(P14K)2のαサブユニットから融合NHaseのαサブユニットドメインに移動します。 コバルトの転移プロセスは、自己サブユニット交換シャペロンのシステイン酸化機能によるシステイン酸化と関連しています9。 このようなプロセスを図６ｂに示す。

apo-NHase-(BA)P14K は融合 NHase の最大 50% までα(P14K)2 によって活性化されましたが、apo-NHase-(BA) は最大 30% の活性しか活性化されませんでした (表 1)。 これらの発見は、apo-NHase-(BA)P14K の構造が apo-NHase-(BA) の構造とは異なる可能性があり、apo-NHase-(BA)P14K が α(P14K)2 によるコバルトの取り込みにより適していることを示しています。 。 apo-NHase-(BA) と apo-NHase-(BA)P14K の違いは P14K 遺伝子の有無にあり、タンパク質 P14K が融合 NHase 構造に影響を与えていることを示しており、P14K はおそらくNHase フォールディングの分子シャペロン。

in vitroではコバルトイオンがα(P14K)2から融合NHaseに転移しましたが(表1)、このプロセスはin vivoでは存在しないはずです。なぜなら、β-およびα-サブユニットが融合して 1 つのタンパク質になります。 P14K は融合 NHase の発現の活性化に必要であり、NHase フォールディングの分子シャペロンとして機能するため、我々は、生体内での NHase-(BA)P14K の翻訳後プロセスを提案しました。 図6cに示すように、BA遺伝子とP14K遺伝子の翻訳後、P14Kは融合βαタンパク質のαサブユニットドメインと接触し、P14Kの助けによりコバルトイオンがαサブユニットドメインに挿入されます。 コバルトの取り込み後、P14K の助けによりタンパク質の折り畳みが起こり、機能的な融合 NHase が形成されます。 P14K は、翻訳後プロセス中に融合 NHase から解離します 25。 このプロセスにおいて、P14K はおそらく、GroEL、Hsp70、Hsp40 などの融合 NHase へのコバルトの取り込みのためのアポタンパク質特異的分子シャペロン 3 として機能し、これらのタンパク質は広範囲のタンパク質に結合してミスフォールディングを防止したり、リフォールディングを刺激したりします 39。

P14Kは最初に融合NHaseへのコバルトの取り込みのために融合βαタンパク質のαサブユニットドメインと接触するため、なぜこのプロセスが野生型NHaseでは起こらないのかという疑問が生じる。 P14Kおよび他の自己サブユニット交換シャペロンは、対応するNHase βサブユニットと顕著な配列類似性（約30％の相同性）を示し（図S3）、両方ともαサブユニットと結合します。 β サブユニットと P14K は、α サブユニットに同じ結合部位を持っている可能性があります。 α サブユニット結合の競合は、野生型 NHase の翻訳後プロセス中に発生します。 その結果、apo-NHase と α(P14K)2 の両方が形成され、その後 NHase 生合成のために自己サブユニットが交換されます。 この場合、αサブユニット結合部位がβサブユニットによって占有されているため、P14Kはβαに結合できません。 NHase-(BA)P14K では、β サブユニットが α サブユニットと融合し、α サブユニット結合部位が解放されます。 したがって、P14K はコバルトを取り込むために融合体 βα の α サブユニット結合部位に直接結合します。

我々は、ほとんどの Co-NHase へのコバルトの取り込みが、in vitro および in vivo の両方で自己サブユニット交換に依存していることを発見しました9,11。一方、α(P14K)2 の α サブユニット内のコバルトイオンは、α(P14K)2 のαサブユニットに直接転送されます。 in vitro での自己サブユニット交換の代わりに、融合 NHase の α サブユニット ドメインを使用します (表 1)。 したがって、野生型 NHase の生合成中になぜ直接伝達が起こらなかったのかという別の疑問が生じます。 両方の機構が野生型 NHase 生合成プロセスで発生する可能性があります。 以前のメカニズムは自己サブユニット交換です。 コバルトとαサブユニットの結合は、自己サブユニット交換シャペロンとαサブユニットの結合よりも強いため、コバルトの直接転移よりもαサブユニットの交換が容易です。 したがって、両方の機構が野生型 NHase 生合成プロセスで発生しますが、自己サブユニット交換はコバルト直接転移の前に起こる可能性があります。 コバルト直接転写の待機機構は、コバルト取り込みの機能を部分的に担っている可能性がある。 その結果、apo-NHase-(BA)P14K および apo-NHase-(BAP14K) は、α(P14K)2 によって部分的にのみ活性化されます (表 1)。 さらに、自己サブユニット交換シャペロンは、αサブユニットへのコバルトイオンの取り込みにおいて重要な役割を果たします。 P14K の C 末端ドメインの柔軟性が、α サブユニットへのコバルトの取り込みの重要な要素の 1 つであることが報告されています 40。 遺伝子BP14KAおよびP14KBAによってコードされる融合NHaseは、P14KのC末端ドメインの柔軟性に影響を与えると考えられます。これは、P14KのC末端ドメインにαまたはβサブユニットが存在し、柔軟性が低下するためです。 これが、2 つの融合 NHase が低い活性を示した 1 つの理由である可能性があります。

遺伝子融合は、実質的に、一対のタンパク質が相互に永続的に相互作用することを強制し、融合イベントは、タンパク質の複雑なトポロジーを単純化することによってアセンブリを最適化する傾向がある 23。 ここでは、遺伝子融合戦略を通じて、優れた特性を持つ 2 つの融合 NHase を構築しました。 インビボでのこの分子進化に伴ってコバルトの取り込み機構が変化し、インビトロで同じタンパク質間で起こる金属イオン移動パターンを発見し、メタロシャペロンの予期せぬ挙動が明らかになった。 NHase へのコバルトの取り込みメカニズムは素晴らしく、変化しやすいため、詳細はさらに調査される必要があります。

Ｐ．プチダ野生型ＮＨａｓｅコード遺伝子ＡＢＰ１４Ｋは、Ｐ．プチダ１２から得られた。 プラスミド pET-24a (+) および pET-28a (+) をベクターとして使用し、大腸菌 BL21 (DE3) を過剰発現に使用しました。

この研究で使用したオリゴヌクレオチドプライマーを表S1に示します。 プラスミドpET24a-BAP14Kを鋳型として使用し、B-Nde I-upおよびP-Hind III-downプライマーをそれぞれNde IおよびHind III制限部位の導入用に設計した。 増幅されたDNA断片をPCR精製キット(Promega)を使用して精製し、Nde IおよびHind IIIで消化し、pET-28a(+)のNde IおよびHind III部位にライゲーションし、次いで大腸菌JM109に形質転換して配列決定した。 配列が正しければ、大腸菌 JM109 からのプラスミド抽出物が大腸菌 BL21 (DE3) に形質転換されたことになります。 組換えプラスミド (pET28a-(BA)P14K および pET28a-(BAP14K)) は、pET28a-BAP14K に基づくオーバーラップエクステンション PCR プロトコールによって構築されました。 pET28a-(BA)P14K および pET28a-(BAP14K) を構築するには、プライマーペア Linker1-up および Linker1-down を使用して β- サブユニットと α-サブユニットを接続し、Linker2-up および Linker2-down を使用して α-サブユニットと α-サブユニットを接続します。 P14Kサブユニット。 次に、pET28a-(BA) は、pET28a-(BA)P14K から (BA) を増幅するプライマーペア B-Nde I-up および A-Hind III-down を使用して構築され、PCR 産物と pET-28a (+) は両方とも4 時間後に Nde I と Hind III で消化されます。 次いで、精製したＤＮＡ断片をｐＥＴ－２８ａ（＋）のＮｄｅ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩ部位に連結した。 組換えプラスミド（pET28a-(BP14KA)およびpET28a-(P14KBA)）は、PCR産物P14K-1およびP14K-2をプライマーとして用いて、pET28a-(BA)に基づくオーバーラップエクステンションPCRプロトコールによってそれぞれ構築した。 PCR 産物 P14K-1 はプライマー ペア B(P)A-up および B(P)A-down で増幅され、P14K-2 はプライマー ペア (P)BA-up および (P)BA-down で増幅されました。 pET24a-BAP14Kをテンプレートとして使用します。

酵素発現用の組換え大腸菌を、まず50μg/mlのカナマイシンを含む10mlの液体2YT培地中で37℃で培養し、次に50μg/mlのカナマイシンを含む2リットルフラスコ中の500mlの液体2YT培地中で培養した。カナマイシンを 37℃、200 rpm で振とうします。 培養物の600 nmでの光学密度（OD600）が0.8に達したとき、イソプロピルβ-D-1-チオガラクトシド（IPTG）を最終濃度0.4 mMまで添加してNHase発現を誘導し、CoCl2・6H2Oを最終濃度まで添加した。 ０．０５ｇ／Ｌの混合物を加えて成熟ＮＨａｓｅを得る。 続いて、培養物を24℃で16時間インキュベートした。

すべての精製ステップは 0 ～ 4 °C で実行されました。 細胞を6,000×gで15分間遠心分離して回収し、10 mM KPB (0.5 mM ジチオスレイトールを含む、pH 7.4)に再懸濁し、氷上で超音波処理して溶解しました。 上清を15,000×gで15分間遠心分離して除去し、孔径0.22μmのフィルターで濾過した。 タグのないタンパク質の精製には、DEAE-Sephacel カラム (3 × 5 ml) (GE Healthcare UK Ltd.) を使用しました。 まず、カラムを 10 mM KPB で平衡化し、タンパク質を KPB 中の 0 ～ 0.5 M KCl の直線勾配で溶出しました。 活性画分を収集し、限外濾過により１mlに濃縮し、SuperdexTM 200 10/300 GLカラム(GE Healthcare UK Ltd.)にアプライし、流速0.5ml/分で10mM KPBで平衡化した。 Hisタグ付き酵素の精製のために、濾液をAKTA精製器(GE Healthcare、テキサス州ヒューストン)を使用してHisTrap HPクロマトグラフィーカラム(GE Healthcare)に適用した。 カラムを緩衝液A(50mMリン酸緩衝液、0.3M NaClおよび20mMイミダゾール、pH7.4)で平衡化し、結合タンパク質を緩衝液B(50mMリン酸緩衝液、0.3M NaClおよび500mMイミダゾール、pH7.4)で溶出した。 。 同様に、Strepタグ付き酵素の精製のために、StrepTrap HPカラム(GE Healthcare UK Ltd.)を結合緩衝液(20mM Na2HPO4・12H2O、280mM NaCl、6mM KCl、pH 7.4)で平衡化した。 上清をカラムに注入し、30 分間インキュベートした後、溶出緩衝液 (25 mM デスチオビオチンを含む結合緩衝液、pH 7.4) でタンパク質を溶出しました。 活性画分を収集し、ゲル濾過の次のステップは上記と同じであった。 精製されたタンパク質はドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) によって分析され、タンパク質濃度はブラッドフォード法 41 によって定量されました。

NHase の分子量と構造を決定するために、精製した酵素とマーカータンパク質を SuperdexTM 200 10/300 GL カラム (GE Healthcare UK Ltd.) に適用しました。 分子量は、マーカータンパク質の標準曲線から外挿により計算されました。 酵素の構造は分子量から推測されました。

NHase活性は生成物の増加によって測定されました。 反応混合物（０．５ｍｌ）は、１０ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．４）、２００ｍＭ ３－シアノピリジンおよび適量の酵素溶液１０μｌを含んでいた。 反応を２５℃で１０分間実施し、０．５ｍｌのアセトニトリルを添加して停止させた。 形成された生成物の量は、215 nmでの吸光度を測定し、標準曲線から外挿することによって決定されました。 NHase 活性の 1 単位 (U) は、これらのアッセイ条件下で 1 分あたり 1 μmol のニコチンアミドを放出する酵素の量として定義されます。

精製酵素（０．５ｍｇ／ｍｌ）を、島津ＡＡ−７０００原子吸光分光光度計を用いて、以下の条件下で分析した：波長、２４０．７３ｎｍ。 ランプ電流、12mA; スリット幅は0.2nm。 精製酵素中のコバルトイオンの量は、標準曲線からの外挿によって計算されました。

UV-V スペクトルは、U-3900 分光光度計 (日立、東京、日本) を使用して室温で得られました。 酵素を10 mM KPB (pH 7.5)に対して透析し、1.0 mg/mlのサンプルを調製した。

BAP14K および融合タンパク質の速度論的パラメーター (Km、Vmax、kcat) は、10 mM KPB 中で 25 °C で測定され、酵素の濃度は 0.2 mg/ml でした。 3-シアノピリジンの濃度は10、20、50、100および200 mMであり、2分後にアセトニトリルで反応を停止させた。 統計分析は、Graphpad Prism 5 ソフトウェア パッケージを使用して実行されました。

熱安定性を決定するために、精製酵素を 50°C で 40 分間インキュベートし、10 分ごとに活性を測定しました。 活性の測定方法は前述の通りである。

製品耐性は、0.5 M ニコチンアミドの存在下での 3-シアノピリジンの減少によって表され、ニコチンアミドを含まないものを対照として使用しました。 リコンビナーゼの生成物耐性を比較するために、ニコチンアミドを含む混合物と含まない混合物における 3-シアノピリジンの減少を測定しました。

酵素活性の最適 pH は、pH 緩衝液 (KH2PO4、3.893 g/l、C6H8O7・H2O、6.008 g/l、H2BO3、1.769 g/l、およびバルビタール Na2、5.266) (pH 6.0 ～ 11.0）。 最も高い活性を示すｐＨを至適ｐＨとして定義し、最も高い活性を１００％とした。

円二色性 (CD) スペクトルは、MOS-450/AF-CD-STP-A (Bio-Logic、フランス、グルノーブル) を使用し、光路長 1 cm の石英キュベットを使用し、タンパク質濃度 0.2 mg/ml で収集しました。 10mM KPB。 分光偏光計とキセノンランプは実験前に 30 分間ウォームアップしました。 190 ～ 250 nm の楕円率を測定し、バッファーブランクのスペクトルを差し引きました。 二次構造タイプを予測するために、公的にアクセス可能な Web サーバー http://k2d3.ogic.ca/ 上でオンライン メソッド K2D3 を使用しました。 この方法により、特に 200 ～ 240 nm の波長間隔とベータストランド含有量の予測が改善されます 42。

以前の研究では、アクチベーター P14K はヘテロ三量体 α(P14K)2 の形でαサブユニットとともに存在することができ、P14K12 の N 末端に Strep タグが付加されると安定に存在することができました。 その結果、pET24a-StrepP14Kを用いてα(StrepP14K)2を作製した。 アポタンパク質はコバルトの非存在下で培養されました。 逆に、コバルト含有タンパク質はコバルトの存在下で培養されました。 精製したapo-NHase (0.1 mg/ml)を精製したコバルト含有α(StrepP14K)2 (0.8 mg/ml)と混合し、続いて10 mM KPB (0.5 mMジチオスレイトールを含む、pH 7.4)中で25℃でインキュベートしました。 。 対照として、精製したapo-NHaseをコバルトイオン(20μM)と同様に混合した。

MALDI-TOF質量分析計(ultrafleXtreme、Bruker Daltonics)を使用して、融合サブユニットの分子量を測定した。 最近導入された MALDI-TOF 質量分析計を使用すると、レーザー誘起フラグメンテーション (LID) によって生体高分子から高品質のフラグメント イオン スペクトルを取得できます。 マトリックス (7.6 mg の 2,5-ジヒドロキシ アセトフェノンを 375 μl のエタノールで希釈し、125 μl の 18 mg/ml クエン酸二水素アンモニウム溶液を加えた) を最初に調製し、2 μl のマトリックス、2 μl の 2% TFA 溶液および 2 μl のサンプル (5 mg/ml）を混合した。 結晶化が観察できるまで、ピペットチップを使用してサンプル溶液を十分に混合しました。 0.5 μl のサンプル溶液を研磨したステンレス鋼のターゲット プレート上にスポットし、乾燥させました。 質量シグナルの定量化は、FlexAnalysis ソフトウェアによって実行されました。

サンプルの処理は、一般的に使用されるプロトコルに従って行われます43。 簡単に説明すると、最初にサンプル溶液を 8 M 尿素中で変性し、ジスルフィド結合をジチオスレイトールによって還元し、すべてのシステイン残基をヨードアセトアミドによってカルボキサミドメチル化しました。 次いで、サンプルを透析によって洗浄し、消化緩衝液(100 mM 重炭酸アンモニウム、pH8.5)中でTPCK-トリプシン(Promega)を用いて消化した。 消化から得たペプチドを SpeedVac 装置 (Thermo) で完全に乾燥させました。 次いで、乾燥したサンプルをサンプル溶液（２％アセトニトリル、０．５％ギ酸および９７．５％水）に再溶解した。 次に、溶解したペプチドサンプルを NanoLC-ESI-MS/MS システムで分析しました。

消化されたタンパク質サンプルの NanoLC-ESI-MS/MS 分析は、内径 75 マイクロメートル、長さ 8 cm の逆相 C18 カラムを備えた高速液体クロマトグラフィー (HPLC) システム (Agilent) によって実行されました。 注射時間は20分でした。 ＨＰＬＣ溶媒Ａは９７．５％水、２％アセトニトリルおよび０．５％ギ酸であり、溶媒Ｂは９．５％水、９０％アセトニトリルおよび０．５％ギ酸であった。 勾配時間は、2% 溶媒 B から 90% 溶媒 B まで 100 分、さらにサンプルローディングに 20 分、カラム洗浄に 20 分でした。 分割後のカラム流量は、毎分約 800 ナノリットルでした。 典型的な注入量は3μlでした。 HPLC システムは、HPLC カラムから溶出されたサンプルがエレクトロスプレー イオン化 (ESI) プロセスによって直接イオン化され、質量分析計に入るという方法で、LTQ 質量分析計 (Thermo) とオンラインで接続されました。 イオン化電圧は毎回最適化され、通常は 1.2 kV ～ 1.8 kV の範囲でした。

この記事を引用する方法: Xia, Y. et al. サブユニット融合ニトリルヒドラターゼの構築と革新的な金属イオン移動パターンの発見。 科学。 議員第6号、19183年。 土井: 10.1038/srep19183 (2016)。

Waldron, KJ、Rutherford, JC、Ford, D. & Robinson, NJ 金属タンパク質と金属センシング。 Nature 460、823–830 (2009)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

オカモト、S. & Eltis、LD コバルトの生物学的発生と密売。 メタロミクス 3、963–970 (2011)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Kuchar, J. & Hausinger, RP 金属部位の生合成。 化学。 改訂 104、509–526 (2004)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

小林 M. & 清水 S. 金属酵素ニトリルヒドラターゼ: 構造、制御およびバイオテクノロジーへの応用。 ナット。 バイオテクノロジー。 16、733–736 (1998)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Van Pelt, S. et al. ニトリルヒドラターゼ CLEA: 産業上重要な酵素の固定化と安定化。 グリーンケム。 10、395–400 (2008)。

記事 CAS Google Scholar

野口哲也、野尻正人、武井和也、尾高正人、神谷直也、フーリエ変換赤外分光法により明らかになった感光性ニトリルヒドラターゼにおけるCys-スルフィン酸およびCys-スルフェン酸のプロトン化構造。 生化学 42、11642–11650 (2003)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Komeda, H.、Koshibaya, M.、Shimishi, S. 反応生成物によって誘導される低分子量ニトリルヒドラターゼ (L-NHase) をコードするロドコッカス ロドクロス J1 nhlBA 遺伝子を含む新規遺伝子クラスター。 Ｊ．Ｂｉｏｌ． 化学。 271、15796–15802 (1996)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

小林 M. & 清水 S. コバルトタンパク質。 ユーロ。 Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． 261、1–9 (1999)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Zhou, Z.、橋本 Y.、白木 K.、小林 M. 自己サブユニット交換による翻訳後成熟の発見。 手順国立アカド。 科学。 USA 105、14849–14854 (2008)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lu、J.ら。 ニトリルヒドラターゼ活性化因子のモチーフ CXCC は、生体内での NHase 生合成に重要です。 FEBS LETT 553、391–396 (2003)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Zhou、Z.ら。 高分子量多量体金属酵素ニトリルヒドラターゼのユニークな生合成: 中間体と自己サブユニット交換成熟の提案された機構。 生化学 49、9638–9648 (2010)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Liu、Y.ら。 自己サブユニット交換は、別の遺伝子型のコバルトニトリルヒドラターゼで起こります。 PLoS ONE 7、e50829 (2012)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yukl, ET & Wilmot, CM タンパク質の翻訳後修飾による補因子生合成。 カー。 意見。 化学。 バイオル。 16、54–59 (2012)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Brown、NM、Torres、AS、Doan、PE & O'Halloran、TV 酸素と銅シャペロン CCS は、Cu、Zn スーパーオキシドジスムターゼの翻訳後活性化を制御します。 手順国立アカド。 科学。 USA 101、5518–5523 (2004)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

荒川哲也 ほか金属結合システイン修飾を含むチオシアン酸ヒドロラーゼの触媒活性化の構造基盤。 混雑する。 化学。 社会 131、14838–14843 (2009)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Liu, J.、Yu, H. & Shen, Z. 分子動力学シミュレーションによる好熱性ニトリルヒドラターゼの熱安定性に関する洞察。 Ｊ．Ｍｏｌ． グラフ。 モデル。 27、529–535 (2008)。

論文 PubMed CAS Google Scholar

長澤 哲、難波 英、竜野 和、竹内 和、山田 博、シュードモナス クロロラフィス B23 のニトリル ヒドラターゼ。 ユーロ。 Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． 162、691–698 (1987)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

渡辺 I.、佐藤 Y.、榎本 K. アクリロニトリル水和活性を持つ微生物のスクリーニング、単離および分類学的特性 (微生物学および発酵産業)。 農業。 バイオル。 化学。 51、3193–3199 (1987)。

CAS Google スカラー

長澤 哲也、清水 宏、山田 博史：アクリルアミドの工業生産における第 3 世代触媒 Rhodococcus rhodochrous J1 ニトリルヒドラターゼの優位性。 応用微生物。 バイオテクノロジー。 40、189–195 (1993)。

記事 CAS Google Scholar

Grossmann, M.、Wong, R.、Szkudlinski, MW & Weintraub, BD ヒト甲状腺刺激ホルモン (hTSH) サブユニット遺伝子融合により、安定性と血清半減期が増加した hTSH が生成され、突然変異誘発によるサブユニット結合の欠陥が補われます。 Ｊ．Ｂｉｏｌ． 化学。 272、21312–21316 (1997)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Azzam, N.、Bar-Shalom, R.、Fares, F. TSH ヘテロ二量体の単一ポリペプチド鎖への変換により、生物活性と寿命が増加します。 内分泌学 153、954–960 (2012)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Legardinier, S.、Poirier, J.-C.、Klett, D.、Combarnous, Y. & Cahoreau, C. ヘテロ二量体および単鎖ウマ LH/絨毛性ゴナドトロピン変異体の安定性と生物学的活性。 Ｊ．Ｍｏｌ． 内分泌。 40、185–198 (2008)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

マーシュ、JA et al. タンパク質複合体は、秩序ある経路を介して集合する進化的選択を受けています。 セル 153、461–470 (2013)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Foerstner, KU、Doerks, T.、Muller, J.、Raes, J. & Bork, P. 真核生物モノシガ ブレビコリスのニトリルヒドラターゼ。 PLoS ONE 3、e3976 (2008)。

論文 ADS PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Liu、Y.ら。 大腸菌におけるシュードモナス・プチダニトリルヒドラターゼ活性化因子P14Kの発現を成功させるための戦略。 BMCバイオテクノロジー。 13、48 (2013)。

論文 PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

MS、ペインら。 立体選択的なコバルト含有ニトリルヒドラターゼ。 生化学 36、5447–5454 (1997)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

村上隆 ほか翻訳後修飾はニトリルヒドラターゼの触媒活性に必須です。 タンパク質科学。 9、1024–1030 (2000)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shearer, J.、Callan, PE および Amie, J. は、金属ペプチドベースの模倣物の使用により、金属タンパク質ニトリルヒドラターゼが触媒活性のために 2 つの酸化システイン酸塩を必要とすることを示しています。 組織。 化学。 49、9064–9077 (2010)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Martinez, S.、Wu, R.、Sanishvili, R.、Liu, D. & Holz, R. ニトリルヒドラターゼの活性部位スルフェン酸リガンドは求核試薬として機能することができます。 混雑する。 化学。 社会 136、1186–1189 (2014)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Swartz, RD、Coggins, MK、Kaminsky, W. & Kovacs, JA チオラート結合およびアルコキシド結合 Co-NHase 類似体によるニトリル水和。 Co (III)-アミデートおよび Co (III)-イミノール中間体の単離。 混雑する。 化学。 社会 133、3954–3963 (2011)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dutta, A. et al. 合成メタロペプチドにおけるチオラートとコバルトメタロセンターの逐次酸化: ニトリルヒドラターゼの生合成への影響​​。 組織。 化学。 52、5236–5245 (2013)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ローゼンツヴァイク、AC メタロシャペロンタンパク質による銅の送達。 準拠化学。 解像度 34、119–128 (2001)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

キュロッタ、VC 他スーパーオキシドジスムターゼの銅シャペロン。 Ｊ．Ｂｉｏｌ． 化学。 272、23469–23472 (1997)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

トッティ、S.ら。 シアノバクテリアのメタロシャペロンは、銅の有害な副反応を抑制します。 手順国立アカド。 科学。 USA 109、95–100 (2012)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

ニュージャージー州ロビンソンとDR ウィンジの銅メタロシャペロン。 アンヌ。 Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｒｅｖ． 79、537–562 (2010)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ciurli, S. et al. ウレアーゼ活性部位の構築のための金属結合シャペロンであるバチルス パストゥリ UreE の分子特性評価。 Ｊ．Ｂｉｏｌ． 組織。 化学。 7、623–631 (2002)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Vignais, PM、Billoud, B. & Meyer, J. ヒドロゲナーゼの分類と系統発生1。 FEMS 微生物。 改訂 25、455–501 (2001)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Barton, BE & Rauchfuss, TB ニッケル鉄ヒドロゲナーゼの活性部位の水素化物含有モデル。 混雑する。 化学。 社会 132、14877–14885 (2010)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hartl, F. 細胞タンパク質の折り畳みにおける分子シャペロン。 Nature 381、571–579 (1996)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

Liu、Y.ら。 シュードモナス・プチダにおけるニトリルヒドラターゼの活性化因子P14K機能に対するC末端ドメインの柔軟性と正電荷の影響。 FEMS 微生物。 レット。 352、38–44 (2014)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Bradford, MM タンパク質と色素の結合原理を利用した、マイクログラム量のタンパク質を定量するための迅速かつ高感度な方法。 アナル。 生化学。 72、248–254 (1976)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Whitmore, L. & Wallace, B. DICHROWEB、円二色性分光データからタンパク質の二次構造を解析するためのオンライン サーバー。 核酸研究所 32、W668–W673 (2004)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shevchenko, A.、Wilm, M.、Vorm, O. & Mann, M. 銀染色ポリアクリルアミドゲルからのタンパク質の質量分析による配列決定。 アナル。 化学。 68、850–858 (1996)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

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この研究は、中国国家ハイテク研究開発プログラム (863 プログラム、2014AA021304)、中央大学基礎研究基金 (JUSRP51411B)、中国国家自然科学財団 (31300087)、および自然科学財団によって財政的に支援されています。江蘇省（BK20130131、BK20130139）、江蘇省高等教育機関の優先学術プログラム開発、111プロジェクト（No. 111-2-06）による資金提供プロジェクト、江蘇省「先進産業発酵共同イノベーションセンター」産業発展プログラム。

教育省産業バイオテクノロジー重点実験室、江南大学バイオテクノロジー学部、無錫、214122、中国

Yuanyuan Xia、Wenjing Cui、Zhongmei Liu、Li Zhou、Youtian Cui、Zhemin Zhou

筑波大学応用生化学研究所および大学院生命環境科学研究科〒305-8572 茨城県つくば市天王台1-1-1

Michihiko Kobayashi

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YX、WC がタンパク質の精製を実行しました。 YX、WC、ZL、LZ、および YC は、in vitro および in vivo の酵素研究を実施しました。 YX、WC、XZ、RS がデータを分析し、原稿を執筆しました。 MK と ZZ が研究を指揮しました。 著者全員が原稿をレビューしました。

著者らは、競合する経済的利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Xia、Y.、Cui、W.、Liu、Z. 他。 サブユニット融合ニトリルヒドラターゼの構築と革新的な金属イオン移動パターンの発見。 Sci Rep 6、19183 (2016)。 https://doi.org/10.1038/srep19183

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受信日: 2015 年 5 月 14 日

受理日: 2015 年 12 月 7 日

公開日: 2016 年 1 月 12 日

DOI: https://doi.org/10.1038/srep19183

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分子生物学レポート (2019)

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