コフィリン 1 の活性化は、細胞外アルファによって誘発される軸索伸長と誘導の欠陥を防止します

Scientific Reports volume 5、記事番号: 16524 (2015) この記事を引用

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10 オルトメトリック

メトリクスの詳細

成人の神経新生の障害と軸索外傷性損傷は、神経変性疾患の重症度に関与します。パーキンソン病に関与するサイトゾルタンパク質であるα-シヌクレインがニューロンから放出される可能性があり、過剰に分泌されたα-シヌクレインが病状の発症と拡大に関与していることが示唆されています。今回我々は、若いニューロンを細胞外αシヌクレインに長期間曝露すると、軸索の伸長と成長円錐の回転が妨げられるという証拠を提供する。我々は、α-シヌクレインによるコフィリンの不活化により、アクチン代謝回転と軸索に沿ったアクチン波の移動速度が変化することを示す。マイクロフィラメントをレーザーで破壊すると、コフィリンのリン酸化の増加により軸索の治癒が促進されますが、それより後の時点では、軸索の治癒が促進されます。神経突起伸長の欠陥が蔓延し、コフィリン活性の調節が失われます。重要なことに、α-シヌクレインに曝露されたニューロンにおける活性型コフィリンの過剰発現は、アクチン波の動き、生理学的軸索伸長、および成長円錐の回転を回復させることができる。私たちの研究は、新生児ニューロンの成長と移動、および成体ニューロンの伸長と再生におけるαシヌクレインによる欠損の分子基盤を明らかにしました。

α-シヌクレイン (Syn) の変異または野生型 (wt) Syn の発現増加に起因する稀なパーキンソン病 (PD) は、早期発症と常染色体優性遺伝を特徴とし、この疾患の病因に Syn が関与していると考えられています 1,2 。 Syn レベルも散発性 PD の発症に関与している可能性があります。ヌクレオチド多型は PD と高度に関連しており、遺伝子転写や mRNA の安定性を変化させることによって Syn レベルに影響を与えることが最近特定されました 3,4。脳脊髄液および血漿中の Syn 検出 5 により、PD における非細胞自律メカニズムの研究の分野が開かれました。線条体に移植された健康なドーパミン作動性移植片は、Syn を含むレビー小体を伴う変性を受け、このことは、分泌された細胞外 Syn が障害の発症に果たす役割の可能性を示唆しています 6,7。ごく最近の研究では、線条体内接種からレシピエント細胞への Syn の移行が、ニューロン間回路に沿った病状の伝播につながるという証拠を提供しました 8。 Syn 遺伝子の増殖による Syn の発現と放出の増加に加えて、神経変性中のあらゆる形態の脳損傷または細胞死によって、単量体細胞 Syn の放出が促進される可能性があります。 Syn 過剰発現の PD モデルでは、ドーパミン作動性ニューロンの喪失に先立って線条体の軸索と末端の変性変化が起こり、Syn 誘発性の病態が最初に軸索と末端に影響を及ぼし、細胞体がダイイングバック機構に関与していることが示唆されています。 Syn 治療を受けた動物に起こる変化の時間経過によって、病気の異なる段階を模倣することができます9。

しかし、高レベルの細胞外 Syn の存在によって引き起こされるニューロンの発達と機能の初期の欠陥はまだ調査されていません。

成人の神経新生は脳の老化や神経変性疾患で影響を受け10,11、神経細胞の喪失により病状の重症度が高まります。海馬の神経新生の減少は、PD 患者と PD 動物モデルの両方で見られています 12、13、14。軸索の伸長と誘導は、発生中のニューロンの正しい移動、統合、接続のための基本的なプロセスであり、アクチン代謝回転とアクチン結合タンパク質の活性によって微調整されるプロセスです。

Syn とアクチンの相互作用は、2 つの神経細胞株で観察された共局在 15 と、D. melanogaster および C. elegans の PD16、17 モデルで観察されたアクチンレベルの調節不全によって示唆されました。 Syn は、in vitro でアクチンと直接相互作用し、培養中の生細胞およびニューロンのアクチン動態に影響を与えることが示されました 18。 Syn の A30P 変異型として高用量の細胞外単量体 Syn は、コフィリン 1 のリン酸化を介したマイクロフィラメントの安定化を通じてアクチンの動態を損なうことが判明しました 19。コフィリン 1 のリン酸化状態を制御するキナーゼおよびホスファターゼの調節不全によるコフィリン 1 活性のバランスの変化は、神経変性と関連しています。加齢やアルツハイマー病に伴うコフィリン 1 の不活化/リン酸化の増加は、スリングショットホスファターゼ 120 の不活化が原因であることが判明しました。アミロイドベータペプチドは、低用量でコフィリンのリン酸化を減少させ、アクチンロッド形成を促進する 21 ことと、LIM ドメインキナーゼを介してコフィリンを不活化することが示されました。高用量での (LIMK) 経路は、アクチン重合に寄与します 22。ロイシンリッチリピートセリン/スレオニンプロテインキナーゼ（LRRK）の欠如、またはプロテインキナーゼA（PKA）に結合できない変異体LRRKは、コフィリンのPKA依存性リン酸化を増加させ、異常なシナプス形成と伝達を引き起こします23。

今回我々は、細胞外送達された野生型またはA30P変異体Synに曝露された培養中の海馬ニューロンは、軸索伸長の欠陥と成長円錐回転の鈍化を示し、一方、アクチン代謝回転が減少し、コフィリン1活性が変化することを示す。 Syns によって誘発される軸索発達における細胞骨格に関連する欠陥はすべて、コフィリン 1 の活性化によって防止できます。我々は、成体の神経新生領域における発達中のニューロンと成熟して確立された接続の両方において、神経ネットワークの正確な配線が行われるメカニズムを提案します。 Syn 誘発神経変性の初期段階で失われます。したがって、コフィリン 1 調節経路は PD 治療の効果的な標的を構成する可能性があります。

我々は以前、Synがアクチン集合を生理学的に調節し、その活性がSyn A30P変異体では大きく変化していること18、そして高レベルの可溶性細胞外Syn（wt型とA30P変異体の両方の形態）もアクチンの動態に影響を与え、マイクロフィラメントを安定化できることを示した19。細胞外環境に存在する Syn の慢性効果を評価するために、解剖直後の胎児海馬ニューロンを 5 μM 精製ヒト組換え wt または A30P Syn と 2 日間インキュベートしました。精製されたタンパク質には凝集体や切断体は含まれず、神経培地との 2 日間のインキュベーション後にはオリゴマーがほとんど存在しませんでした 24。対照サンプルと比較して、細胞外Synsに曝露されたインビトロ（DIV）2日目のニューロンでは、細胞体および成長円錐の周囲の糸状仮足および葉状仮足の増加が明らかであり（図1a）、これはアクチンの集合と安定化の増加を示しています。

細胞外シンはアクチン可動性画分を減少させます。

（ a ）5μM精製wtまたはA30P Synの非存在下または存在下で2日間インキュベートした2 DIVマウス胎児海馬ニューロンにおける、蛍光ファロイジン染色によって明らかにされたF-アクチン分布。（ b ）アクチン-YFPに感染したニューロンを軸索に沿って漂白し（左パネル、四角）、3 DIV、1フレーム/0.6秒で60秒間画像化しました（右パネル）。 (c) コントロール (青)、wt Syn (緑)、および A30P Syn (赤) で処理したニューロンにおける時間の経過に伴う光退色後のアクチン YFP 蛍光回復の平均曲線。Syns から得られた曲線のプラトーの値が低いことに注目してください。処理されたニューロン。 (d) 対照および(a)と同様にSynsで処理したニューロンにおける、全蛍光に対する移動画分のパーセンテージおよび蛍光回復の時定数(e)の定量的評価。 (d、e) では、データは平均値 ± SEM として表されます。 (c–e) では、ctrl、n = 19、wt Syn、n = 24。 A30P Syn、n = 24、3 つの独立した培養物から。統計的有意性は、一元配置分散分析とその後の多重比較のためのダネット検定によって決定されます。 *P < 0.05; **P < 0.01。 (d) P = 0.0046、アルファ値: 0.050:0.791。 (e) P = 0.5170 ns、アルファ値: 0.050:0.049)。 (a、b) のバーは 10 μm。

細胞骨格の形態と動態に対する細胞外 Syn の観察された効果が安定化されたマイクロフィラメントの増加によるものであるかどうかを理解するために、光退色後の蛍光回復 (FRAP) の実験を実行しました。 FRAPは、アクチン-YFPにウイルス感染した3 DIVのニューロンに対して実行されました。対象領域（ROI）は、調べたすべてのニューロンの細胞体から同じ距離にある軸索の中心に選択されました（図1b）。光退色後の蛍光強度の回復は、対照領域で正規化した後に定量化されました。蛍光回復の時定数はアクチン重合の速度と相関しており、蛍光が到達するプラトーは、アクティブなトレッドミリングを受けているフィラメントの割合を示します（図1c）。これらのパラメーターを定量化すると、Syns処理ニューロンでは、挿入速度は変化しなかったものの、可動率が対照と比較して約35％減少したことが示されました（図1d）。これらの結果は、遊離アクチンモノマーのプールが少なく、バランスがマイクロフィラメントの安定した重合状態に向かってシフトしていることを示唆しています。

アクチン細胞骨格の破壊または安定化により、軸索が伸長できなくなり、細胞外の合図に応答して回転できなくなる可能性があります。走化性ダンチャンバーは、化学誘引物質の勾配に対するニューロンの反応を研究するために使用されました。外側のウェルには、PKA 活性化因子である 20 μM 8-ブロモアデノシン 3',5'-環状一リン酸 (8-Br-cAMP) の溶液が含まれていました (図2a)。実験前にニューロンをwtおよびA30P Synなしまたはありで2日間インキュベートし、30分間のタイムラプスイメージングによって8-br-cAMPに対する反応を調べた。誘引物質の合図の存在下での軸索の回転方向の分析により、対照ニューロンは化学誘引物質の濃度が増加する方向に成長の軌道を変更したが、Syns処理ニューロンは誘導合図に従う能力を失ったことが示された（図2b））。 8-Br-cAMP の適用から 30 分後の軸索の成長方向を定量化すると、コントロールニューロンでは 100% の陽性反応が示され、Syns 処理ニューロンでは 50% の陽性反応が示され、これはランダムな挙動を示しています (図 1)。 2c)。回転軸索の成長速度も、野生型およびA30P Syn処理ニューロンでは大幅に減少しました（図2d）。総合すると、これらの結果は、Synsによるアクチン代謝回転の減少が、軸索の伸長や正しい移動など、発達中のニューロンの機能欠損と相関している可能性があることを示唆しています。

細胞外シンは軸索の誘導を妨げます。

(a) 拡散によって勾配を形成する 40 μM 環状 8-br-cAMP で満たされた外側ウェルを備えたダンチャンバー上で逆さまに組み立てられたカバースリップ上で培養されたニューロン。ニューロンは、1 フレーム/分で 30 分間画像化されました。画像は、勾配の適用から 0 分および 30 分で示されています (上部の灰色のバー)。（ b ）2 DIVでのctrl、wtおよびA30P Syn処理ニューロンにおける実験の30分間に誘引物質キューの勾配に曝露された成長軸索の軌跡プロット。化学誘引物質の供給源はプロットの上部にあります。軸索の初期方向は水平軸と一致しました。 (c) (b) のように処理されたニューロンにおける引力勾配に向かう軸索の割合の定量的評価。各実験のニューロンからのデータがプールされ、独立した実験からのデータを比較して統計分析が実行されました。（ d ）wtまたはA30P Synの有無にかかわらず処理したニューロンにおける30分間の軸索伸長の定量的評価。 (c、d) では、データは平均値 ± SEM として表されます。 (c) では、ctrl、n = 30; 重量シン、n = 17; A30P Syn、n = 18、3 つの独立した培養物から。 d Ctrl では、n = 20。重量シン、n = 14; A30P Syn、n = 12、3 つの独立した培養から。統計的有意性は、一元配置分散分析とその後の多重比較のためのダネット検定によって決定されました。 *P < 0.05; ***P < 0.001。 (c) P = 0.0001、アルファ値: 0.050:1.000。 (d) P = 0.0424、アルファ値: 0.050:0.450) a のバー: 10 μm。

成長中のニューロンでは、アクチン波が細胞体から成長円錐に伝わり、軸索の成長を促進します。我々は、神経突起の動態のパラメータとしてアクチン波の速度を使用しました。実際、DIV 初期のニューロンではアクチン波がより頻繁に発生し、より速く発生します。 2 DIVでのニューロンのタイムラプスイメージング中に、細胞体から軸索の先端まで移動する成長円錐状の構造がはっきりと見えました（図3a）。アクチン波にはアクチンとアクチン結合タンパク質であるコフィリン1が含まれていましたが、軸索の中心に存在する微小管はアクチン波には存在しませんでした（図3b）。 Syns の有無にかかわらずインキュベートされたニューロンは 1 フレーム/2 分で画像化され、アクチン波の速度は、波が成長円錐の先端に到達するまでにかかる時間を計算して決定され、軸索の長さに対して正規化されました (補足ビデオ 1)。。対照サンプルと比較して、細胞外Synsに2日間曝露されたニューロンは、見た目は健康で動的な成長円錐を示していたにもかかわらず、アクチン波の速度が約20％減少しました（図3c）。我々は以前、細胞外Synがコフィリン1の不活性化を通じてアクチン動態に間接的に作用し、アクチンフィラメントの安定化を促進することを示した19。したがって、我々は、コフィリン 1 が Syns に慢性的に曝露された後、不活性状態にあるのではないかと疑問に思いました。ニューロンをSynsに2日間曝露し、リン酸化された不活性コフィリン1のレベルを免疫ブロットによって定量しました（図3d）。リン酸化コフィリン1のレベルは、対照と比較して、wt Synとインキュベートしたニューロンでは実際に1.8倍、A30P Synとインキュベートしたニューロンでは2倍増加しました（図3e）。不活性コフィリン 1 の局在の研究は、2 日間 Syns で処理したまたはしなかったニューロンの蛍光コフィリン 1 で染色された領域からホスホコフィリン 1 免疫蛍光領域を差し引いて行われました（図 3f）。サブトラクション画像により、染色が存在しない濃縮ホスホコフィリン 1 の領域が明らかになり、特にアクチン波は Syns 処理ニューロンで染色を示さなかった（図 3f、中および下のパネル、矢印）。これは、コフィリン 1 の不活化により、アクチン細胞骨格はアクチン波の中でそのダイナミクスを失いました。アクチン波の速度と細胞骨格の重合状態との相関関係をさらに評価するために、アクチンの集合を調節する薬剤を使用しました。ニューロンを、マイクロフィラメントの安定剤であるジャスプラキノリド（Jaspla）およびモノマー隔離タンパク質であるラトランキュリン A（LatA）に 20 分間曝露し、薬物を洗い流し、ニューロンを 3 時間画像化しました。実際、Jasplaによる治療後、Syn効果と同様にアクチン波の速度が20％減少し、LatA治療によりアクチン波の速度が上昇しました（図3g）。これは、解重合によりアクチン波の動きがバーストされることを示唆しています。

Syns の存在下では、アクチン波の動きが遅くなり、高濃度の p-コフィリン 1 が含まれます。

(a) 細胞体から成長円錐に進むアクチン波を示す 2 DIV 胎児海馬ニューロンの微速度撮影画像。ニューロンは、2 分ごとに 1 フレームで 3 時間画像化されました。 (b) ファロイジン (F-アクチン) およびチューブリンおよびコフィリン 1 に対する抗体で染色した 2 DIV のニューロンの蛍光分析。アクチンとコフィリン 1 は波形 (矢印) に存在しますが、チューブリンは除外されています。（ c ）wtまたはA30P Synの有無にかかわらず2日間処理され、（a）と同様に画像化されたニューロンで計算されたアクチン波速度の定量化。（ d ）wtまたはA30P Synの有無にかかわらず処理したニューロンからの細胞ホモジネート中の右側に示されるタンパク質のレベルを示す代表的なイムノブロット。アクチンは内部標準として示されています。（ e ）（ d ）に示す各実験条件について、デンシトメトリーによって分析され、アクチンレベルで正規化された、p-コフィリン1とコフィリン1のバンド間の比率の定量化。（ f ）wtまたはA30P Synの有無にかかわらず2日間インキュベートし、コフィリン1およびp-コフィリン1について処理したニューロンの蛍光分析。右側のパネルには、p-コフィリン1について染色された領域をからの減算から得られた画像が示されています。コフィリン 1 について染色された領域。(g) 2 μM LatA で 20 分間、または 12 nM Jaspla で 20 分間処理したニューロンで計算したアクチン波の速度の定量化。 (c、e、g) では、データは平均値 ± SEM として表されます。 cでは、ctrl、n = 59; 重量シン、n = 60; A30P Syn、n = 76、5 つの独立した培養物から。 (e) では、n = 3 の独立した実験。 (g) では、ctrl、n = 74; LatA、n = 20; Jaspla、n = 23、3 つの独立した文化から。統計的有意性は、一元配置分散分析とその後の多重比較のためのダネット検定によって決定されました。 *P < 0.05; **P < 0.01。 (c) P = 0.0012、アルファ値: 0.050:0.890。 (e) P = 0.0086、アルファ値: 0.050:0.477。 (g) P = 0.0012、アルファ値: 0.050:0.897)。 (a、f) のバーは 10 μm、(b) 上の列は 10 μm、下の列は 2 μm。

脳外傷とニューロンの損傷は、PD 症状を悪化させる状態です。アクチン細胞骨格は損傷した軸索の修復と再生に関与しているため、Syns が治癒プロセスを妨害するのではないかと考えました。サブナノ秒パルス UVA レーザーを使用して、高度に制御され再現可能な方法で軸索の部分的損傷を作成しました。低出力のレーザー（1.8μW）は、神経膜の完全な切除を伴わずに軸索の薄化を引き起こし（図4a、赤いスポットおよび補足ビデオ2）、軸索の細胞骨格の3つの要素の局所的な破壊を引き起こしました25。病変後に縮小した軸索と成長円錐は短時間で元の形状に戻り、数分でアクチン波が病変上を移動し始め、成長円錐に進みました (補足ビデオ 3)。 Syns の非存在下または存在下での定常状態での波速を使用して、損傷したニューロンと損傷していないニューロンのダイナミクスを比較しました。

シンは、軸索損傷後のアクチン波の動きを促進します。

(a) UVA レーザー (赤いスポット) による損傷前 (左パネル) と損傷後 (中央パネル) の 2 DIV のニューロン。右側のパネルには、損傷前（上）と損傷後（下）の病変領域の拡大図が示されています。（ b ）wtまたはA30P Synの有無にかかわらず2日間処理され、図3aのように画像化された損傷ニューロンにおけるアクチン波の速度の定量化。（ c ）染色前（左パネル）、2μM LatAの20分後（中央パネル）、および薬物を洗い流して2時間後（右パネル）の胎児海馬ニューロンの蛍光分析（共焦点画像のZスタック）。ファロイジン (F-アクチン) (赤)、コフィリン 1 (青) および p-コフィリン 1 に対する抗体 (緑) を含みます。 (d) (c) に示す各実験条件における、p-コフィリン 1 とコフィリン 1 の蛍光強度の比の定量化。（ e ）2μM LatAの存在下または非存在下で20分間処理し、薬物を2時間洗い流した後のニューロンからの細胞ホモジェネートにおける、右側に示されるタンパク質のレベルを示す代表的な免疫ブロット。アクチンは内部標準として示されています。（ f ）eに示す各実験条件について、デンシトメトリーで分析したp-コフィリン1とコフィリン1のバンド間の比率の定量化。（ g ）wtまたはA30P Synの有無にかかわらず2日間処理され、UVAレーザーで損傷されたニューロンにおける16時間の軸索伸長の定量化。 (b、d、f、g) では、データは平均値 ± SEM として表されます。 (b) では、ctrl、n = 30; 重量シン、n = 35; A30P Syn、n = 32、3 つの独立した培養物から。 (d) では、3 つの独立した文化からの各条件の n = 5。 (f) では、n = 3 の独立した実験。 (g) では、ctrl、n = 25; 重量シン、n = 18; A30P Syn、n = 13、4 つの独立した培養物から。統計的有意性は、一元配置分散分析とその後の多重比較のためのダネット検定によって決定されました。 *P < 0.05; **P < 0.01。 (b) P = 0.2956、ns、アルファ値: 0.050:0.083。 (d) P = 0.0043、アルファ値: 0.050:0.942。 (f) P = 0.0316、アルファ値: 0.050:0.683。 (g) P = 0.0141、アルファ値: 0.050:0.659)。 (a) 中央のパネルのバーは 10 μm、右のパネルは 1 μm、(c) のバーは 20 μm。

対照ニューロンでは、損傷によりアクチン波の速度がわずかに減少しました。予想外なことに、野生型およびA30P Syn処理ニューロンでは、損傷後のアクチン波の速度は対照と同様でしたが（図4b）、損傷を受けていないSyns処理ニューロンのアクチン波の速度と比較して有意に高かった（図3c）。）。 Synsの存在下のように、アクチンが解重合しにくくなり、マイクロフィラメントが安定化した状態では、フィラメントのトレッドミル運動に必要なアクチンモノマーのプールが不足し、アクチン波の動きが遅くなると考えられる。損傷後など、マイクロフィラメントが局所的に破壊された場合、モノマーのプールが局所的に復元され、活性な重合が促進されます。

この仮説を検証するために、ニューロンを LatA で処理しました。アクチン脱重合を誘導する LatA は、局所的ではないものの、軸索全体に関与する病変を模倣した状態を表している可能性があります。我々は、アクチン波の速度がLatA治療により速いことを示し（図3g）、治癒プロセスを促進できるSynsとLatAの共通の標的はどれであるかを尋ねました。 LatAによって誘導されるような全身的な脱重合は、おそらく、マイクロフィラメントの形態の回復を目的とした細胞内のフィードバック機構を活性化する可能性がある。 LatAをニューロンに20分間適用すると、免疫染色（図4c、d）およびp-コフィリン1のイムノブロット（図4e、f）。マイクロフィラメントの重合を促進するコフィリン 1 の不活化は、薬物の存在下、および同様にレーザー誘発損傷によってマイクロフィラメントが解重合された後の Syns の存在下でのアクチン波の速度の増加を説明できるでしょう。。コフィリン 1 の不活化による Syns の急性保護効果は、損傷後の後の時点での軸索伸長の変化の可能性を排除しませんでした。プレーティング後、ニューロンを Syns とともにインキュベートし、2 DIV で上記のように軸索を損傷し、ニューロンを 16 時間画像化しました。軸索が追跡され、映画の最初と最後のフレームの間で長さの増加が計算されました (図 4g)。実際、損傷後およびSynsの存在下では、伸長は対照よりも30%低く、コフィリン1の慢性的な不活化が一時的に破壊されたフィラメントの再重合を促進する可能性があるものの、その後の時点で軸索の再生が損なわれることを示しています。

コフィリン 1 のリン酸化状態、ひいては細胞骨格の安定化を、Syn によるアクチン波速度の減少と相関させるために、ドミナントネガティブおよびドミナントネガティブコフィリン 1 コンストラクトを使用しました。ニューロンは、野生型コフィリン 1、または構成的に活性であるコフィリン 1 の非リン酸化性 S3A 変異型、または構成的に不活性である擬リン酸化 S3E 変異体のいずれかを用いてエレクトロポレーションされました。コフィリン 1 の RFP タグ付きコンストラクトをエレクトロポレーションしたニューロンは、トランスフェクション効率を考慮して計算すると、内因性コフィリン 1 の平均 2 ～ 4 倍のレベルで外因性タンパク質（図 5a、RFP コフィリン）を発現しました（トランスフェクション効率は約 30% ～ 40）。 %。 S3A コフィリン 1 過剰発現は著しく速い波を誘導し、S3E コフィリン 1 過剰発現ニューロンではその逆が当てはまり (図 5b)、アクチン波運動を促進するためのコフィリン 1 調節の重要性を示しています。重要なことに、Synsに曝露されたニューロンにおけるS3Aコフィリン1の過剰発現は、アクチン波の運動速度を回復することができ(図5c)、Synによるタンパク質の不活性化のバランスをとった。

活性コフィリン 1 は、軸索の伸長と回転における Syn による欠陥を防ぎます。

(a) RFP-wt コフィリン、RFP-S3A コフィリン、RFP-S3E コフィリン、または対照としての RFP をエレクトロポレーションしたニューロンからのホモジネート中の右側に示されたタンパク質を示す免疫ブロット。 (b) (a) と同様の構築物をエレクトロポレーションしたニューロンにおけるアクチン波の速度の定量化。（ c ）RFPまたはRFP-S3Aコフィリンをエレクトロポレーションし、wtまたはA30P Synの非存在下または存在下で2日間インキュベートしたニューロンにおけるアクチン波の速度の定量化。（ d ）RFPまたはRFP-S3Aコフィリンでエレクトロポレーションされ、wtまたはA30P Synの有無にかかわらず処理されたニューロンにおける30分間の軸索伸長の定量化。（ e ）エレクトロポレーションされ、（ d ）と同様に処理されたニューロンにおける誘引勾配に向かう軸索のパーセンテージの定量化。各実験のニューロンからのデータがプールされ、独立した実験からのデータを比較して統計分析が実行されました。 (b–e) では、データは平均値 ± SEM として表されます。統計的有意性は両側 t 検定によって決定されました。 (b) では、RFP/S3A、P = 0.0176、アルファ値: 0.050:0.747。 RFP/S3E、P = 0.0381、アルファ値: 0.050:0.273; RFP、n = 41; 重量コフィリン、n = 13; S3A、n = 43; S3E、n = 11、3 つの独立した文化から。 c では、RFP/wt Syn、P = 0.0226、アルファ値: 0.050:0.547。 RFP/A30P Syn P = 0.0191、アルファ値: 0.050:0.181; 重量 Syn/S3A + 重量 Syn P = 0.0291、アルファ値: 0.050:0.604; A30P Syn/S3A + A30P Syn、P = 0.0135、アルファ値: 0.050:0.421; RFP、n = 43; 重量シン、n = 17; A30P Syn、n = 20; S3A + wt Syn、n = 14; S3A + A30P Syn、n = 27、3 つの独立した培養から。 dでは、RFP/wt Syn P = 0.0231、アルファ値: 0.050:0.634; RFP/A30P Syn P = 0.0282、アルファ値: 0.050:0.602; 重量 Syn/S3A + 重量 Syn、P = 0.0035、アルファ値: 0.050:0.884; A30P Syn/S3A + A30P Syn、P = 0.0426、アルファ値: 0.050:0.540; RFP、n = 33; 重量シン、n = 13; A30P Syn、n = 13; S3A + wt Syn、n = 9; S3A + A30P Syn、n = 10、3 つの独立した培養から。 e では、統計的有意性は、一元配置分散分析とそれに続く多重比較のダネット検定によって決定されました。***P < 0.001、(RFP/wt Syn、RFP/A30P Syn、P = 0.0001、アルファ値: 0.050:1.000)、および両側 t 検定による: wt Syn/S3A + wt Syn P = 0.0012、アルファ値: 0.050:0.874; A30P Syn/S3A + A30P Syn、P = 0.0044、アルファ値: 0.050:0.688; RFP、n = 43; 重量シン、n = 17; A30P Syn、n = 20; S3A + wt Syn、n = 14; S3A + A30P Syn、n = 27、3 つの独立した培養から。

これらの結果に基づいて、アクチン波の運動速度と軸索伸長との相関関係を調べるために、構成的に活性なコフィリン 1 が軸索成長速度の欠陥を防ぐ能力をテストしました。 S3A コフィリン 1 でエレクトロポレーションされ、上記のように Syns に 2 日間曝露されたニューロンを画像化し、30 分後に軸索の長さを計算しました。モックトランスフェクトされたニューロンをwtおよびA30P Synに曝露すると、トランスフェクトされていないニューロンで観察されたように、軸索伸長の有意な減少が誘導され（図2d）、活性コフィリン1の発現は、コフィリン1の存在下で生理学的成長速度を回復することができました。 Syns（図5d）。

さらに、コフィリン活性に対するSynの効果、その結果生じる細胞骨格動態の変化、および成長円錐回転の間の相関関係を確認するために、我々は、活性型コフィリン1が、細胞内で失われた誘引物質の合図に対する軸索の反応を回復する能力を評価した。細胞外Synの存在。 S3A コフィリン 1 をモックトランスフェクトまたは発現しているニューロンを、8-Br-cAMP の勾配を作成してダンチャンバー内で分析しました。 SynsとランダムにインキュベートしたRFP発現ニューロンの50％のみが誘引物質の合図に向かって向きを変えましたが、S3Aコフィリン1の発現により正しい反応が回復し、軸索の80〜100％が勾配に従って向きを変えることができました（図5e）。

これらの結果を総合すると、標的タンパク質であるコフィリン 1 に作用する Syn 効果を防ぎ、ニューロンの伸長および標的に向かって移動する能力を回復できる可能性を示しています。

この研究では、細胞外に放出されたSynが、損傷後のニューロンの発達と再生の障害の根底にある軸索伸長と誘導の欠損に寄与し、PDなどの神経変性疾患の重症化に関与しているという証拠を提供します。

我々は以前、アクチンの動態が細胞外環境における過剰なwtまたはA30P Synの存在によって影響を受け、その結果マイクロフィラメントの安定化が生じることを実証しました19。今回我々は、細胞外Synsへのニューロンの長期曝露が、軸索に沿った可動性アクチンの割合が低いことから示されるアクチン代謝回転の減少と相関していることを示す。ニューロンはアクチン構造が豊富であるように見え、細胞体の周囲と神経突起先端に大きな葉状仮足があり、アクチン安定化薬によって誘発される効果を思い出させます。

Synコーディング遺伝子の増殖は早期発症型PD2、26、27で起こり、一貫して高濃度のwt SynはA30P変異Synと同様に作用し、過剰なwtタンパク質の病理学的役割が確認された。興味深いことに、腹側被蓋野のニューロンに対する黒質のドーパミン作動性ニューロンの選択的脆弱性は、高齢のサルやヒトのこれらのニューロンで見られる Syn レベルの増加と相関している可能性があります 28。

神経変性疾患の根本的な原因である軸索損傷は、遺伝子発現、タンパク質複合体、タンパク質の再局在の変化を引き起こします。損傷した軸索における Syn 濃縮 29 は、再生発芽と成長円錐の経路探索における役割の可能性を示唆しています。アクチンの動態は軸索の誘導に必要であり、アクチンの集合が存在しない場合には誘導されない軸索の成長が発生します 30。アクチンの局所的な破壊は、成長円錐がこの領域から背を向け、安定した糸状仮足を含む方向に成長することを誘導します 31。

私たちは、細胞外 Syns への慢性的な曝露により、生理学的成長中と病変後の再成長中の両方で軸索の伸長が遅くなることを報告します。我々は、神経突起の動態のパラメーターとして使用されるアクチン波の速度 32 が軸索伸長と相関し、Syns の存在下では減少することを発見しました。アクチン波にはアクチンとコフィリン 1 が含まれていることが示されていますが、Syns 処理はアクチン波におけるリン酸化コフィリン 1 の蓄積を誘導しました。一貫して、アクチン波の速度は、アクチン脱重合薬である LatA の存在下で増加し、アクチン安定化薬である Jaspla の存在下で減少しました。軸索損傷後、我々の以前の結果 25 で示されたように、マイクロフィラメントは部分的に遮断され、アクチンダイナミクスの重合化へのシフトにより損傷の治癒が促進され、実際、Syns の存在下でのアクチン波の速度は損傷前よりも高かった。しかし、その後の時点では、Syn の存在によるアクチン代謝回転の減少によって軸索の再生が妨げられました。コフィリン 1 活性とアクチン波の速度との相関関係を LatA を使用して評価しました。 LatAによって誘導されるマイクロフィラメントの解重合の状態では、損傷した軸索の状況と同様に、フィードバック機構としてアクチン波の速度が増加し、コフィリン1が不活性化された。 LatA を洗い流した後、コフィリン 1 は脱リン酸化されて状態を制御し、活性を回復してアクチン動態のバランスをとりましたが、Syns の存在下ではコフィリン 1 は慢性的に不活性なままでした。

アクチン切断タンパク質であるコフィリン 1 は、アクチンモノマーのプールを維持し、したがって集合/分解ダイナミクスを強化することによってアクチンフィラメントを再構築します 33。 LIMK を含む複数のキナーゼによるコフィリン 1 の保存されたセリン 3 残基のリン酸化は、そのアクチン脱重合活性の阻害につながります 34,35。コフィリン 1 の活性は、軸索伸長と成長円錐の運動性に関与しており 36、37、38、網膜ニューロンでは、コフィリン 1 は糸状仮足の動態の調節において脳由来神経栄養因子 (BDNF) の標的として機能します 39、40。

さらに、成長円錐の誘導におけるコフィリンの役割がアフリカツメガエルの脊髄ニューロンの骨形成タンパク質に応答して最近示され 41、神経成長因子 (NGF) とネトリン-1 が成長円錐の細胞膜突出を刺激し、同時に活性コフィリンを増加させることが示されました。。活性コフィリンの局所的増加は誘引性転向を誘導し、コフィリン活性の低下によりNGFまたはネトリン-142への転向が鈍化した。

我々は以前、Synsが原形質膜の外表面での78 kDaのグルコース関連タンパク質（GRP78）の蓄積によって引き起こされるRac1/LIMK経路を介してコフィリン1の不活化を誘導することを示した。今回我々は、神経培地中に2日間存在するSynがコフィリン1の慢性的なリン酸化を維持し、これらのニューロンでは誘引物質の合図に対する成長円錐の反応が失われたという証拠を提供する。実際、ニューロンにおける活性型コフィリン 1 の発現により、成長円錐の魅力的な回転を回復することができました。一貫して、活性型コフィリン 1 の発現は、Syns によって誘導される軸索伸長およびアクチン波の運動速度の欠損も防止しており、コフィリン 1 が新生ニューロンの発達および損傷ニューロンの再生における Syns の病理学的活動の主な標的であることを示しています。 Syn トランスジェニック動物における細胞死の増加と新生児ニューロンの生存の減少は、伸長とシナプス統合の欠陥による可能性があり、これらの病理学的影響を及ぼす Syn の量の増加による毒性が示されています 12。

さらに、コフィリン 1 活性とニューロトロフィンとの関係は、アクチン波の数と運動速度を回復することも示されており 25、PD および関連シヌクレオパチーの治療における治療標的としてのニューロトロフィンの使用を強化しています。

すべての化学試薬は、Sigma Aldrich (ミズーリ州セントルイス) および GE Healthcare (スウェーデン、ウプサラ) から購入しました。ガラス底ペトリ皿はMattek Corp（マサチューセッツ州アシュランド）から入手し、ダンのチャンバーはHawksley（英国ランシング）から入手した。

マウスモノクローナル抗体：抗アクチン（Sigma Aldrich）。抗コフィリン 1 (Abcam、ケンブリッジ、マサチューセッツ州)。ウサギポリクローナル抗体：抗リン酸化コフィリン 1（Santa Cruz Biotechnology、カリフォルニア州サンタクルーズ）。抗βチューブリン III (Covance、エマービル、カリフォルニア州)。

蛍光結合 Alexa Fluor 二次抗体は Molecular Probes (オレゴン州ユージーン) から入手しました。ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次抗体（Bio-Rad、カリフォルニア州ハーキュリーズ）。 FITC結合ファロイジン(Molecular Probes-Life Technologies、カリフォルニア州カールズバッド)。

pmRFP-N1 ヒトコフィリン wt (カタログ番号 50856)、pmRFP-N1 ヒトコフィリン S3A (カタログ番号 50857)、および pmRFP-N1 ヒトコフィリン S3E (カタログ番号 50858) の DNA (Addgene (マサチューセッツ州ケンブリッジ) は James Bamburg から寄贈されました) 。

pET21d プラスミドに挿入されたヒト全長 wt または A30P Syn をコードする構築物は、Brett Lauring 博士 (コロンビア大学、ニューヨーク州、米国) からの親切な贈り物でした。細菌を、1 mM イソプロピル-D-1-チオガラクトピラノシドを用いて対数増殖期に2時間誘導し、遠心分離によって回収した。ペレットを緩衝液A (HEPES/KOH 20 mM、pH 7.2およびKCl 100 mM)に可溶化し、90℃で5分間加熱した。細胞溶解物を 72,000 × g で 30 分間遠心分離し、上清を HiTrap monoQ カラム Syn にロードし、100 ～ 500 mM の KCl の直線勾配で溶出し、目的の画分を Centricon 遠心分離フィルターを使用して濃縮しました。 Synを含む画分をプールし、濃縮し、-80℃で保存した。 Syn 純度を制御するために、1 mg の精製 Syn を Superdex 75 10/300 カラム (GE Healthcare) の上部にロードし、AKTA Purifier 装置で 0.5 ml/min で溶出しました。光学密度 (OD) を 280 nm で連続的に測定し、50 ng の精製 Syn を SDS-PAGE ゲルにロードし、クーマシーブリリアントブルーで染色しました。

初代ニューロン培養物は、C57BL/6S E18 マウス (Harlan、Udine、Italy) から解剖された海馬から得ました。動物は病原体のない動物施設で維持された。すべての実験は、イタリア保健省によって承認された実験手順に厳密に従って行われました。

胚を取り出し、無菌条件下で解剖した。海馬は、トリプシン中での酵素消化によって解離されました（0.125％、37℃で30分間）。トリプシン活性は、10% ウシ胎児血清 ( FBS、Gibco). トリプシン処理後、組織を FBS を含まない完全培地ですすぎ、プラスチックピペットで解離した. 長期イメージングのためにニューロンをガラス底のペトリ皿に播種しました (直径 10 mm のガラス底に 20,000 個のニューロンの密度) ; または免疫細胞化学用のガラス製カバースリップ上 (直径 18 mm のカバースリップ上で 30,000 個のニューロンの密度); または走化性アッセイ用のガラス製のカバースリップ上 (正方形 #3D) (20 × 26 mm のカバースリップ上で 50,000 個のニューロンの密度); またはプラスチック製ペトリマルチウェル上イムノブロット用ディッシュ (直径 30 mm ディッシュ上に 350,000 ニューロンの密度) プレーティングから 2 時間後、2 ml の無血清グリア馴化培地を添加しました。

E18マウスから皮質を切除し、冷HBSSに入れ、次いでトリプシン0.125%+1mg/mlのDNAse中で室温で15分間インキュベートし、上清を保存し、トリプシン中でのインキュベーションを繰り返した。 2 つの上清をプールし、8 °C、1500 rpm で 5 分間遠心分離しました。細胞を、ＭＥＭ＋１０％ウマ血清、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、３３ｍＭグルコースおよび２ｍＭグルタミン中に再懸濁した。グリア細胞を、0.01 mg/ml ポリ-D-リジンでコーティングしたT75 フラスコに播種しました。１００％コンフルエンスに達したとき、ＭＥＭ培地をＮｅｕｒｏｂａｓａｌ完全培地に置き換えた。 2日後、グリア馴化培地を海馬ニューロンに添加した。

O-05 プログラム (Amaxa Biosystems、ケルン、ドイツ) の初代ニューロン用 Basic Nucleofector Kit を使用して、解離直後に初代海馬ニューロンを懸濁液中でエレクトロポレーションしました。ニューロンは、4D-NucleofectorTM Core Unit (Amaxa) で対象のコンストラクト (800 ng pmRFP-N1 ヒトコフィリン wt、400 ng pmRFP-N1 ヒトコフィリン S3A、400 ng pmRFP-N1 ヒトコフィリン S3E/1,000,000 ニューロン) でエレクトロポレーションされ、上で説明したように、ガラスのカバースリップまたはプラスチックのペトリ皿にメッキします。エレクトロポレーションされたニューロンを 3 DIV で使用しました。

DIVニューロンを氷上の氷冷HBSSで洗浄し、溶解緩衝液(100μlの1% SDS)中で掻き取った。サンプルを 100 °C で 2 分間煮沸し、5 秒間超音波処理し、12,000 rpm で 15 分間遠心分離しました。５×サンプル緩衝液（２５０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌｐＨ６．８、１０％ＳＤＳ、３０％グリセロール３０、５％ β－メルカピタルエタノール、０．０２％ブロモフェノールブルー）を各タンパク質サンプルに添加した。タンパク質は、SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (PAGE) および免疫ブロッティングによって分離されました。

海馬ニューロンを播種し、wt または A30P Syn で 2 日間処理しました。対照インキュベーションは、クロマトグラフィー溶出バッファーを添加することによって得られました。ニューロンを 4% PFA で固定し、FITC 結合ファロイジンで 1 時間染色しました。 2 μM LatA (Molecular Probes-Life Technologies) で処理したニューロンを、Lat A ウォッシュアウトの 20 分後および 2 時間後に固定しました。 12 nM Jaspla (Molecular Probes-Life Technologies) で処理したニューロンを 20 分で固定しました。共焦点画像は、Leica 63x 対物レンズ (NA 1.4; Leica Microsystems、Wetzlar、ドイツ) を使用して Leica SP2 共焦点顕微鏡で取得しました。すべての画像は ImageJ (NIH、ベセスダ、メリーランド州) で分析されました。

長時間の明視野タイムラプス実験（最大 16 時間）は、多点連続画像取得用のレーザーベースのオートフォーカスと電動ステージを備えた市販の倒立顕微鏡（Eclipse Ti E; Nikon Instruments Inc.）で実行されました。顕微鏡には電荷結合素子 (CCD) カメラ (Andor DU-897D-C00)、Plan Fluor 40x、0.75 NA DIC 対物レンズ、およびイメージングソフトウェア (Nis elements AR; Nikon Instruments Inc.) が装備されており、約 10 個のニューロンがイメージングされました。各条件で 2 分のフレーム間隔で画像を撮影しました。

長期のタイムラプスイメージングでは、倒立顕微鏡に適合する特注の細胞インキュベーターステージでニューロンを 35 °C の安定した温度に保ちました 43。生理学的 pH を維持するために、空気とバランスをとった 5% CO2 のガスを流量計 (CO2BX、Okolab) で混合し、サンプルホルダーに通しました。さらに、ＣＯ２は透過するが水は透過しない油の膜（ポリジメチルシロキサン２００流体、０．９１３ｇ／ｍｌ、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）を培地上に堆積させた。ニューロンの画像は多点取得によって選択され、フレームごとに 1 または 2 分の間隔で画像化されました。

レーザー切断源は、355 nm のパルスサブナノ秒 UV Nd:YAG レーザー (PNV001525-040、PowerChipnano-Pulse UV レーザー、Teem Photonics、メイラン、フランス) でした。パルスエネルギーが1.8μWに減少すると、軸索への損傷はネックの形成に限定されるようでした。軸索44の中央に切除を行った。

ダン室を Neurobasal で事前に洗浄し、次にグリア馴化培地で 2 回洗浄しました。馴化培地を加えて内側および外側のウェルを満たした。ニューロンを含むカバースリップをダンチャンバー上で裏返し、外側のウェルを排出および再充填するための狭いスリットを端に残した。余分な培地を濾紙で吸い取ることによって除去し、ダンチャンバーの３つの側面を熱パラフィン：ワセリン（１：１）で密封した。ゲルローディングチップを使用して、外側ウェルからすべての液体を充填スリットを通して除去し、馴化培地で希釈した40μM 8-br-cAMP (BioLog Life Science Institute、Bremen、ドイツ)を外側ウェルに添加した。次に、充填スリットを熱いパラフィン:ワセリンで密閉しました。ダンのチャンバーは、培地の pH の変化を避けるために迅速に組み立てられました。ダン室の組み立て後、直ちに画像化を開始した。 20 倍の対物レンズを使用して、30 分間、毎分位相コントラスト画像を取得しました。各ダン室について、環状ブリッジの周囲のさまざまな場所で約 15 のステージ位置が画像化されました。次に、勾配の方を向くニューロンの割合を計算しました。

2 mlの無血清グリア馴化培地を満たしたガラス底ペトリ皿に播種した海馬ニューロンを、DIV 1でpLenti4-アクチンYFPウイルスに感染させた。ニューロンを5μM wtまたはA30P Synの存在下または非存在下で2日間インキュベートした。。実験は 3 DIV のニューロンを使用して実行されました。 FRAP実験は、63倍の油対物レンズ(Leica Microsystems)を使用してLeica TCS SP5顕微鏡で実施されました。関心領域 (ROI) が選択され、退色前信号として 20% の強度で 488 nm レーザーを使用して発光信号が取得されました。続いて、ROI を 458 nm、476 nm、および 488 nm の 3 つのレーザーで光退色し、すべて強度を 100% に設定しました。退色後の取得は、1 フレーム/0.6 秒の速度で 60 フレーム実行されました。各フレームの ROI の強度は、漂白前のフレームの平均初期強度と漂白された軸索の面積に対して正規化されました。蛍光の回復は、視野内のコントロール領域で定量化されたライブイメージング中に発生する不要な光退色に対して補正されました。各時点での蛍光の強度 (F) は、Leica Analyzing Software によって自動的に生成されました。最初の 5 フレームで計算された平均強度は退色前 (Fpre) 値に対応し、8 番目のフレームの平均強度は、6 番目と 7 番目のフレームで発生する光退色フェーズ後の強度値 (F0) です。

各実験の個々のプロットをモデル関数に当てはめました。アクチン YFP の蛍光回復は単一指数関数によって最もよく適合され (二重指数関数は適合の品質を大幅に改善しません)、異なる回復速度を持つ可動性アクチン画分の存在が明らかになりました。次のモデルが適用されました。

- A はアクチンの可動性画分の % です。

- B は蛍光回復の時定数です。

A と B は各曲線のフィッティングから得られました。各条件について、蛍光の回復率および蛍光回復の時定数について、平均±SEMを計算しました。

最後のグラフは、(F − F0)/Fpre の正規化された蛍光強度値を Y 軸に、時間 (秒) を X 軸に示します。曲線のフィッティングは Matlab で行われました。統計分析はGraphPadソフトウェアで実行されました。

画像の合成と描画は、Adobe Photoshop (Adobe System、カリフォルニア州サンノゼ) を使用して行われました。データはGraphPad Prismソフトウェア(Graph Pad、カリフォルニア州ラホーヤ)を使用して分析し、平均値±標準誤差(SEM)として表した。統計的有意性は、一元配置分散分析とその後の多重比較のダネット検定によって決定されました (P 値 < 0.05 を有意であるとみなしました)。

この記事を引用する方法: Tilve, S. et al. コフィリン 1 の活性化は、細胞外 α-シヌクレインによって誘発される軸索伸長と誘導の欠陥を防ぎます。科学。議員 5、16524; 土井: 10.1038/srep16524 (2015)。

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Syn プラスミドについては、Brett Lauring (コロンビア大学、ニューヨーク州、ニューヨーク州) に感謝します。また、顕微鏡実験に関する技術サポートをしていただいた M. Pesce にも感謝します。この研究はテレソン財団 GGP10109 (EC 宛) の支援を受けました。

イタリア工科大学神経科学・脳技術学部、ジェノヴァ、16163、イタリア

シャラーダ・ティルヴェ、フランチェスコ・ディファト、エヴェリーナ・キエレガッティ

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ST、FD、EC が実験を考案し、設計しました。 ST は実験を実施し、データを分析しました。 ECが論文を執筆した。

著者らは、競合する経済的利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Tilve, S.、Difato, F. & Chieregatti, E. コフィリン 1 の活性化は、細胞外 α-シヌクレインによって誘発される軸索伸長および誘導の欠陥を防ぎます。 Sci Rep 5、16524 (2015)。 https://doi.org/10.1038/srep16524

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受信日: 2015 年 8 月 17 日

受理日: 2015 年 10 月 15 日

公開日: 2015 年 11 月 12 日

DOI: https://doi.org/10.1038/srep16524

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