In の臨床応用と利点

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固相抽出 (SPE) は、イオン抑制を引き起こすことが多いマトリックスから対象分析物を分離するために使用される一般的なサンプル前処理手法です。 市場で最も一般的な SPE 形式は、カートリッジ、96 ウェル プレート、オンライン、および QuEChERS として存在します。 最後の例を除いて、SPE は伝統的に固定吸着床で製造されていました。 このプレゼンテーションでは、比較的新しいフォーマットであるピペットチップ内分散型 SPE、DPX (Dispersive Pipette eXtraction) を紹介します。

MilliporeSigma が最近開発したポリマー HLB (親水性-親油性バランス) 吸着剤を含む DPX チップは、複数の生物学的マトリックス (尿と血清) にわたるいくつかの臨床/毒物学用途で使用されました。 DPX HLB チップを使用したワークフローは手動で完了できますが、このウェビナーではロボットリキッドハンドラーを使用したサンプル前処理の完全な自動化に焦点を当てます。 時間とコストの節約を含む、この新しいテクノロジーの利点についても説明します。

参加者は、以下についてさらに詳しく学びます。

ヒュー・クレイマー科学者ミリポアシグマ

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皆さん、こんにちは。ラボ マネージャーの製品スポットライト ウェビナー シリーズへようこそ。 私の名前は Mary Beth de Donna です。今日のディスカッション、臨床応用、ピペットチップ内分散型 SPE の利点について司会を務めます。 私たちはウェビナーが非常にインタラクティブであることを望んでいます。そのため、今日のウェビナー中にいつでも質問を送信することをお勧めします。 私たちの講演者は、プレゼンテーション後の質疑応答のセッションでこれらの質問に答えます。 質問するかコメントを残すには、画面の右側にある Q&A ボックスに質問を入力するだけです。

ご一緒にお時間をいただく中で、できるだけ多くの質問にお答えできるよう努めてまいります。 ただし、時間が足りなくなった場合は、未回答の質問を講演者に転送します。可能であれば講演者が直接お答えします。 このウェビナーの録画は、このプレゼンテーションの直後にオンデマンドで利用できるようになります。 ラボマネージャーからのメールと、この無料ビデオが公開されたらアクセスする方法をご覧ください。

また、スポンサーのmilliporesigma様にも心より感謝申し上げます。 彼らのサポートにより、ラボマネージャーはこれらのウェビナーを読者に無料で提供できます。 それでは、このウェビナーのプレゼンターを紹介したいと思います。 Hugh Kramer は、分析化学のアプリケーションと製品、およびドイツのダルムシュタットにある Merck KGaA の事業であるミリポレシグマに 35 年以上取り組んできた経験があります。 彼は GC 化学者として仕事を始め、その後数年間 QC 領域を監督し、その後 HPLC のアプリケーション領域に加わりました。 研究開発近年、彼の主な焦点はサンプル前処理 HPLC および LC ms メソッドの開発です。本日ご参加いただきありがとうございます。

ドイツのダルムシュタットにある Merck KGaA のライフ サイエンス事業は、米国とカナダで milliporesigma として運営されています。

今日のウェビナーでは、DP X インターセプト形式とその使用方法について説明します。 次に、このアペル スイフト HLB 素材を見ていきます。 自動化されたプロセスでのヒントを示す短いビデオを示します。 今日は申請書も3件載せました。 最初は尿からのオピオイド薬、次に血清からのステロイドです。 最後に、THC CBD とその代謝産物を見ていきます。これもチップ形式の DP x 血清からのものです。 今日は、間もなく発売される革新的な製品である DP x インチップ SPE を皆さんと共有したいと思います。 DP X は分散ピペット抽出の略で、特許取得済みの技術です。 従来の固相抽出とは異なり、吸光度が 2 つのフレット間にしっかりと詰め込まれておらず、チップ内に緩やかに含まれています。 チップで溶液を吸引して分注することで機能します。 写真を見ると、先端の下部に吸収材が上にある部分にフレットがあります。

また、途中に混合を助ける青い分散器があることにも注目してください。 ここでは、96 ウェル プレートを処理する準備ができている GPX チップをロードした 8 チャンネル パイプ パターンを示します。 この図は、SPE に一般的な典型的なバインドウォッシュ エリュード抽出プロセスを示していますが、DP X チップでは、SPE のようなフロースルーの代わりに吸引ディスペンス機能を使用します。 左から右へ、コンディショニングから始めます。 コンディショニング溶液が引き上げられ、吸引されて分配されます。 次に、結合ステップに進み、分析物をこの吸収剤にロードします。 次のステップは、干渉を洗い流すウォッシュアップです。

最後に、強力な溶媒を使用して対象分析物を溶出します。 次のいくつかのスライドでは、メソッド開発ガイドの推奨事項を確認します。 まず、HLB 素材ではコンディショニングが必ずしも必要というわけではありません。 時にはそれが回復を助けることもあります。 それは分析物に依存します。 通常、このコンディショニング ステップには 5 ～ 30% のメタノールが使用されます。 1 ml チップを使用する場合、約 750 マイクロリットルを使用します。通常は 1 ～ 2 時間の分離で十分です。 結合ステップでサンプルをロードするには、通常 3 回または 4 回の吸引分注サイクルを使用します。 つまり、通常はそれで十分です。 水性の非粘性サンプルがある場合は、サンプル量より少し多めの空気を吸引できます。

したがって、約 300 マイクロリットルのサンプルがある場合は、ピペットを約 400 マイクロリットルに設定できます。 そして、追加の 100 マイクロリットルの空気が混合を助けます。 血清や油状液体のような粘性のあるサンプルがある場合、これを行うのはあまり良い考えではありません。 したがって、今までと同じ音量を維持するだけです。 適切な結合を確実に得るために、このステップではソリューションのオーガニックを約 5% のみにすることをお勧めします。 干渉を除去するために使用される洗浄サイクルでは、プロセス内で単一の溶液を使用することも、一連の溶液を使用することもできます。 これを行うには、10% メタノール溶液を 2 回だけ吸引して使用するのが一般的です。 より多くの干渉を除去する必要がある場合は、メタノールのパーセントを増やすことができますが、それはすべて対象分析物の極性に依存します。

分析対象物の溶出には、有機含有量の高い溶液が使用されます。 前のステップで得られた水が少し残る可能性があるため、この溶液は水と混和する必要があります。 当社のデータシートには、チップ内の吸着剤の質量に基づいて溶出量を示唆する表が含まれています。 バインドステップで行ったように空気を吸引して回復や回復を助けるという提案は、1つの大きなイリュージョンだけでなく、複数のイリュージョンアレックワッツによって改善される場合があります。 当社の DPS HLB チップはさまざまな形式で利用できます。

写真の左側には、microevolution チップが見えます。 マイクロ エボリューション チップの大きな利点は、溶出量が 25 マイクロリットルと少ないことです。 このヒントは、ハミルトン形式でのみ利用可能です。 右側に 1 つの ML タイプのピペットチップが見えます。 ユニバーサル形式とハミルトン形式の両方で利用できます。 アリューシャン式の体積は 3 ～ 800 マイクロリットルの範囲です。

もう 1 つのコメントでは、従来の影付き部分があるか、1 ml サイズのチューブ内に小さな粒子のように見えることがわかります。 これは、吸収材の先端が緩んでいるために発生する典型的な現象です。 DP x フォーマットと従来の SPE の違いには、溶液がトップロードではなくピペットで吸引および分注されることが含まれます。 これにより、関数は流量ではなく平衡に基づいたものになります。 緩い吸着剤により接触表面積が最大になり、速度が向上します。 ESPYS が優れた技術であることは誰もが知っているので、これらを議論の余地のある利点として列挙します。 その中で使用される方法はたくさんあります。 しかし、DP x hi 分析物回収の高スループット、迅速な抽出時間、高い再現性、および自動化互換性により、接触速度と混合速度が向上していることがわかります。

次のセクションでは、これらのヒントに含まれる内容を確認します。 この場合、それはスペルスウィフトHLB素材です。 Spell Swift HLB 材料はポリマー固定相です。 ATL B は親水性と親油性のバランスを表します。 この構造には、水性サンプルからの広範囲の化合物の抽出に役立つ親水性官能基とリポ Vic 親和性官能基の両方が含まれています。 この表は、HLB 材料の特徴と利点を示しています。

繰り返しますが、POLAR、NONPOLAR、酸性から塩基性までの幅広い分析対象で、容量が大きいほど、ベッド重量が小さくなり、溶出量が少なくなるように感じます。 これは、サンプル処理の時間を節約するのに役立ちます。 DP X カートリッジ フォーマットには適用されない耐性のあるオーバードローをリストしますが、一部の SPE と他の SPE は重要です。

また、当社の厳格な製造 QC 基準により一貫性がもたらされ、精度と精度が向上していることに注目します。 次のスライドでは、DB X ヒントを簡単に自動化できることを示すビデオを紹介します。 ここで少し免責事項を記載しておきますが、退屈しないようにビデオは通常の 2 倍の速度で再生されます。 そして、緑色の食品着色料から青色が回復することを示しています。 このステップではコンディショニングは行われません。 ここでは、ロボットが GPX チップとその肉を拾い上げ、緑色の食品着色料が入ったウェルに移動するのがわかります。 それらを吸い上げて、吸引して同じウェルに再び注入します。

チップの底部のサポートに青色が残っているのがわかります。 洗浄ステップに進みます。20% メタノールの溶液を作成し、水で分配します。状態がよくわかります。チップの底に水色が見えます。洗浄ステップに進みます。 100% メタノールで満たされたアリューシャン式の遺言は、それを引き上げると、ライトがサポートからメタノールに移動し、そのままメタノールに戻されます。 それは後の分析に任せます。

応用セクションは、尿からのオピオイド薬の抽出から始まります。 この抽出では、13 種類のオピオイド薬と尿からの内部標準が抽出されました。 これらは広範囲のログ PS を表します。 最初の 3 つ、またはログ p が 1 未満のものは、通常、CA チームのフェーズで保持するのが困難であることに注意してください。 クリーンアップは、Hamilton 自動液体サンプラーの DPS HLB チップを使用して実行され、その後 LC ms ms で実行されました。 分析。 この特定の研究が行われたとき、私たちの主な関心はチップ間の変動を調べることでした。

そこで、かなり大きな 20 ML サンプルを準備し、その同じサンプルを 8 つの異なるピペット チップで使用しました。 ここでは、抽出を実行するためにサンプルをハミルトン自動液体サンプラーに移す前に手動で行ったサンプル前処理手順を左側に示します。 まず、尿、beta kluk Your Honor day 溶液のリン酸緩衝液、スパイクされた分析物、およびそれらの内部標準を組み合わせました。 次いで、この溶液を６０℃で２、３時間加熱した。 これにより、Bakel Beta Glucan Your Honor days 酵素がグルクロニド代謝産物を加水分解して親薬物に戻すことが可能になります。

この場合、チップは調整され、5% メタノール溶液を使用し、結合ステップで 4 回吸引分注し、5% メタノール溶液で再度洗浄しました。 次に、5% ギ酸のメタノール溶液を使用して解決を実行し、良好な回収率を得るために吸引と分注を 2 回行いました。 次いで、サンプルを１００倍および１５０マイクロリットルの溶液で希釈し、次いで、ＬＣＭＳによって分析する前に、３５０マイクロリットルの水で希釈した。 このスライドは、サンプルの LCMS 分析に使用される条件を示しています。

右側の重ねられた MRM シグナルは、Santas Express フェノール Hexcel カラムが 6 分未満で優れた分離能を示していることを示しています。 このスライドは、その抽出の結果を示しています。 各分析対象物の回収率は 75 ～ 120% であり、全体の平均は約 96% です。すべての RSD では一般的に 10% 未満です。表には、各分析対象で使用される内部標準がリストされています。 対応する回復率と RSD パーセントを回復します。 今日取り上げる次のアプリケーションは、血清からのステロイドパネルです。 この作業は GPX テクノロジーズの Madison Kilpatrick によって実行され、milliporesigma の James Ross が情報の収集を手伝ってくれました。

この方法は、血清が使用する 2 つの異なる供給源から使用されるさまざまなステロイドを分析するために開発されたもので、血清認定基準物質と NIST の総濃度が決定されました。 この場合、microevolution チップを使用して非常に低いレベルに到達し、続いて LC ms ms 分析が行われました。 このスライドでは、メソッドで使用されるサンプル前処理と抽出プロセスについて詳しく説明します。 内部標準を血清に添加し、1 時間インキュベートします。 次に、ギ酸溶液を加えてタンパク質を解離し、さらに 15 分間インキュベートします。 チップ内の吸着剤は、メタノールと水の 20% 溶液で調整されました。

結合には、洗浄サイクルをこのプロセスに組み込むよりも、良好な結合を確実にするために 5 回の吸引下降サイクルを使用しました。 最初は 100% 水のみを使用してバルクタンパク質を洗浄し、次に 20% メタノールを含む 2 回目の洗浄を使用して残りの干渉を除去します。 最後に、対象の分析物は 5050 メタノールまたはスギ ニトリルで溶出されます。 ここに示されている散布図は、DPS ステップを使用して決定された濃度値と、認定標準物質血清で提供された値との間の全体的な相関関係が非常に優れていることを示しています。 左側のグラフは、y 軸に DP X の結果、x 軸に U tack 基準材料の結果を示す uTec 基準材料です。 右側のグラフは NIS 材料プロットです。

ここでは、NIS 資料のみからの詳細な結果を示します。 スライドが少し忙しいことは承知していますが、この方法が提供する優れた感度と精度を強調したいと思いました。 この最後のアプリケーションはボーナスだと思います。 私たちが実証してきた ATL B マテリアルは使用されていません。 代わりに、この研究では血清からの THC、CBD、およびそれらの代謝物の分析に当社のハイブリッド SPE 材料を使用します。 通常、カンナビジオールとその代謝物は、THC とその代謝物とは別個に分析されます。

しかし、構造が類似しているため、THC CBD と血清タンパク質沈殿からの代謝産物を定量する方法と、Hamilton 自動脂質液体ハンドラーで実行されるハイブリッド SPE クリーンアップの両方に使用できる単一の方法を開発することを選択しました。 そして私たちは内部標準を使用します。 タンパク質と脂質は、血液および血清タンパク質における最も一般的なマトリックス干渉であり、一部の脂質は有機溶媒の沈殿またはクラッシュによって除去できます。

残りのリン脂質は、LCMS 分析におけるイオン抑制の一般的な原因であり、マトリックス効果を除去するために彼が使用したハイブリッド SPE 材料は、化学濾過として機能します。 右の図では、リン脂質のリン酸基がどのようにジルコニウムイオンと相互作用して除去されるかを示しています。 以下のサンプル調製は、Hamilton リキッド ハンドラーで実行されました。 最初の 300 マイクロリットルの Spike 血清を内部標準とともに各ウェルに入れます。 次に、1% ギ酸を含む Cedar ニトリルに石炭を加えてタンパク質の沈殿を実行します。

ウェルプレートを１２００ＲＰＭで３分間撹拌し、この４００マイクロリットルの上清を沈降させ、新しいウェルに移す。 次に、それらはハイブリッド GPX チップで処理され、チップは最初に 5% クエン酸を含む手順ニトリルでコンディショニングされ、次に上清がチップにロードされ、吸引と分注が 2 回行われます。 このステップではリン脂質が濾過され、引数は LCMS でさらに処理するために新しいウェルに分注されます。

サンプル前処理の結果は、左側に棒グラフで示されており、回収率は各分析物についておよそ 80 ～ 20 120% の間であり、良好です。 次に、各分析対象のマトリックス クリーンアップの表の右側です。 血清抽出物というタイトルのカラムは、汚れたタンパク質を沈殿させた後にサンプルをハイブリッド材料でさらに処理した後に得られるものです。

したがって、マトリックスのクリーンアップの違いは、このカンナビジオールのハイブリッドによる改善が大幅に改善されていることを示していますが、代謝産物では、イオン抑制が 40% から 51% から 16% に低下し、14% に低下したという大幅な改善が示されています。 TA TC は、イオン抑制が得られず、その分析物のイオン増強が得られるという点で興味深いものであり、再びイオン抑制を使用しないと、高い数値から低い数値に改善され、血清抽出物だけを使用すると 207% の増強が得られます。ハイブリッド クリーンアップ後は 166% に減少します。 そして他の 2 つの分析物についても同様です。

ここでも、DP X ハイブリッド SPE 素材を使用したクリーンアップにより改善が見られます。 今日のプレゼンテーションを復習すると、分散ピペット抽出 (DP X) は革新的な特許技術であり、SPE 研修生がピペット チップを使用する利点があります。 吸収剤はチップ内に緩く含まれており、溶出量が少ないことが大きな利点です。 HLB D px チップは、広範囲の化合物の抽出に使用されます。 バインダー洗浄戦利品プロセスを使用し、尿と血清マトリックスの両方から容易に検体を良好に回収します。 ハイブリッド DPS チップは、総レベルのリン脂質を除去するためのシンプルで一般的な方法です。対象のバン ライトに結合しない化学濾過干渉を使用し、バン ライトの血清マトリックスから優れたクリーンアップを実現します。 本日はご参加いただきありがとうございました

わかりました、素晴らしいです。 素晴らしいプレゼンテーションをありがとうございました。 それでは、この時点で質疑応答に移りたいと思います。 遅れて参加された方も、画面の右側にある Q&A ボックスに質問を入力して送信してください。 また、このウェビナーで説明した Chappelle swift HLB 固相抽出チップが、提示されたアプリケーション ノートとともに近日発売されることもお知らせします。 詳細については、milliporesigma の続報をお待ちください。

画面の右側にある Q&A ボックスに質問やコメントを残してください。 私たちはあなたの名前と電子メールアドレスを記録します。 したがって、この技術が利用可能になったらミリポシグマから連絡を希望する場合は、Q&A ボックスにコメントを残してください。 ここ。 素晴らしいプレゼンテーションをありがとうございました。 ここからは早速 Q&A に入っていきましょう。 聴衆からの最初の質問は、チップで使用できるサンプルの量の範囲はどれくらいかというものです。

この使用量はチップのベッド重量に基づいており、さまざまなベッド重量をご用意しています。 ただし、ベッド重量が 3 マイクロ 3 ミリグラムの小さなマイクロ溶出チップの場合は、150 ～ 300 マイクロリットルの範囲をお勧めします。 大きめの1mlチップ用。 510 ミリグラムまたは 20 ミリグラムのいずれかの容量と材料が付属しています。当社の製品データシートには、推奨する容量をリストした表があります。 したがって、5 ミリグラムの場合は 300 マイクロリットル未満のサンプル量を使用することをお勧めします。10 ミリグラムの場合は 600 マイクロリットル未満のサンプル量を使用することをお勧めします。 また、20 ミリグラムという大容量のサンプルを使用すると、最大 800 マイクロリットルのサンプル量を測定できます。

わかりました、素晴らしいです。 どうもありがとう。 次の質問に移りましょう。SPE カートリッジや 96 と比較して、これらのヒントを使用して回復方法を教えてください。 ウェルプレートでは、DP x の場合と同等か、あるいはもう少し良い回収率が得られるはずですが、その場合は従来の SPE または 96 ウェルプレートを使用します。 そしてこれはおそらく、それが平衡に基づいているという事実と関係があるでしょう。 分散は流量ではなく平衡速度と等しく、すべての SPE 抽出が最適な流量で行われるわけではありません。 したがって、もしあなたがその流量を外れた場合、おそらく最適な回復よりも少し少ない回復が期待されるでしょう。

わかりました、素晴らしいです。 ありがとう。 次へ移りましょう。 さらにいくつかの質問が寄せられています。これは、アプリケーションに必要なベッドの重量をどうやって見つければよいですか?というものです。

繰り返しになりますが、推奨事項を記載した表がありますが、HLB 材料の場合、材料の容量は約 10% です。 したがって、予想される回収率やサンプルの重量がわかっていれば、それに基づいて作業することができます。 しかし、ベッドの重量はできるだけ軽量にしたいと常に考えています。 その場合、より低い溶出量で使用すると感度が高くなるためです。 ただし、繰り返しになりますが、これはポリマー材料の約 10% の容量に基づいています。 そして、一般的には、できる限り最小のベッド重量と最小の溶出量を維持しようとします。

わかりました、素晴らしい、ありがとう。 ここで別の質問があります。 これは、この技術と互換性のあるサンプル量の上限はどれくらいかを示しています。

もう一度、サンプル量の範囲に関する最初の質問に戻りますが、上限はおそらく 800 マイクロリットル程度の量になるはずです。 そして、繰り返しになりますが、そこにはベッドの重量との関係があるということです。 わかった。

わかりました、素晴らしいです。 ありがとう。 ここでさらにいくつか質問があります。 これは、チップ内の H lb ポリマーの質量が何であるかを示しています。その質量は、私たちがリストしたベッドの重量であるため、ミクロの錯覚で、ステロイドの塗布のためのチップ内の質量は 3 ミリグラムでした。マイクロガリシアン錯視チップでは3ミリグラムを使用し、オピオイドアプリケーションではベッド重量の5ミリグラムを使用し、ハイブリッドクリーンアップアプリケーションではベッド重量の50ミリグラムを使用したと思います。

わかりました、素晴らしいです。 ありがとう。 ここでもう 1 つ質問する時間があると思います。 これは、「マルチチャンネルロボットアームテクノロジーを使用する場合、ピペッティングの精度にばらつきはありますか?」と述べています。

ピペッティングにばらつきはありますか? 正確さ？ この質問を私が解釈するのであれば、それは素晴らしい質問だと言えます。 そして、私がそれを正しく解釈していれば、ヒント全体での変動は非常に低いです。 最初のアプリケーションで私たちが研究したことの 1 つは、同じサンプルを使用して 8 つのチップ全体で調べたところ、ばらつきが非常に小さいことがわかりました。

わかりました、ありがとう。 お時間がありましたら、実は別の質問もいただいております。 たとえば、複数の Alex ロットのサンプルをロードしようとしたことがありますか。吸着剤がその量の分析物をサポートできる場合、サンプルの 800 URL を 3 回ロードできますか?

きっとできると思います。 実に興味深い質問ですね。 私はその仕事、その仕事をしたことがありません。 しかし、それは良い実験になるでしょう。 そしてそれがこれらのヒントの良いところです。 とてもフレンドリーなフォーマットなので、私たちは皆ピペッティングに慣れています。 これらの小さな実験はすべてベンチトップで実行できます。 非常に迅速に。 したがって、そのような研究は非常に早く完了する可能性があります。 ご質問ありがとうございます。

わかりました、素晴らしいです。 本当にありがとう。 このウェビナーで説明した Chapelle swift HLB 固相抽出のヒントが、提示されたアプリケーション ノートとともに間もなく発売されることをもう一度お知らせします。 ミリポシグマにご期待ください。 詳細については、この技術が利用可能になったらミリポレシグマから連絡を希望する場合は、右側の Q&A ボックスにコメントを残してください。または、連絡することもできます。

Hugh さんのメール アドレスと QR コードが目の前の画面に表示されます。 そのため、より詳しい情報を得ることができます。 これでこのウェビナーは終わりになります。 繰り返しになりますが、このウェビナーは、このプレゼンテーションの直後にオンデマンドで利用できるようになります。 このビデオが公開されたら、ラボマネージャーからのメッセージが届く電子メールをご覧ください。

研究室長を代表して。 クレイマー氏のプレゼンテーションに多大な労力を費やしてくれたことに感謝したいと思います。 本日はお忙しい中、ご参加いただきまして誠にありがとうございます。 スポンサーのmilliporesigma様に改めて感謝申し上げます。 彼らのサポートにより、ラボマネージャーはこれらのウェビナーを読者に無料で提供できるようになります。 今後開催されるすべてのウェビナーまたはオンデマンドウェビナーの詳細、または研究室用の最新ツールやテクノロジーの詳細については、当社の Web サイト (lab manager.com) をご覧ください。 ぜひまたご参加いただければ幸いです。 ありがとう、そして素晴らしい一日をお過ごしください。