Geobacter sulphurreducens では熱力学的に制限された条件下で細胞質内膜が発達する

npj Biofilms and Microbiomes volume 9、記事番号: 18 (2023) この記事を引用

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メトリクスの詳細

Geobacter sulfurreducens は、環境中の金属酸化物や人工システムの電極を還元できる電気活性細菌です 1,2。ジオバクター sp. それらの呼吸は他の生物によって生成された発酵生成物を消費し、酸化鉄や電極などの末端電子受容体を還元するため、起電性バイオフィルムの要となる生物です。広範囲の酸化還元電位を持つ細胞外電子受容体を呼吸するために、G. sulfurreducens は呼吸タンパク質の複雑なネットワークを持ち、その多くは膜結合しています 3,4,5。我々は、G. sulfurreducens の細胞質内膜 (ICM) 構造を同定しました。この ICM は、未知のメカニズムによって折りたたまれて組織化された内膜の陥入であり、常にではありませんが、多くの場合、細胞の先端近くに位置します。共焦点顕微鏡を使用すると、低電位アノード表面で増殖させた場合には細胞の少なくとも半分に ICM が含まれるのに対し、高電位アノード表面で増殖させた細胞や電子受容体としてフマル酸塩を使用して増殖させた細胞では ICM 周波数が大幅に低かったことがわかります。低温電子断層像から作成された 3D モデルは、ICM が細胞質および細胞質周辺腔と接触する内膜の連続的な拡張であることを示しています。異なる熱力学的条件下で増殖した細胞における ICM の存在量の違いは、膜結合呼吸タンパク質の増加により電子束が増加する可能性があるため、ICM が限られたエネルギー利用可能性への適応であるという仮説を裏付けています。したがって、ICM は余分な内膜表面を提供して、これらのタンパク質の存在量を増加させます。 G. sulfurreducens は、ICM を生成することが発見された最初の Thermodesulfobacterium または金属酸化物還元剤です。

私たちは古典的に細胞質の細胞小器官の区画化の違いによって原核生物と真核生物を区別していますが、現実はより複雑です。多様な代謝と生態学的ニッチを持つ原核生物は、明確に定義されたさまざまな細胞内小器官を発現します6、7、8。原核生物で特徴付けられている細胞小器官のほとんどは、2 つのカテゴリーのいずれかに分類されます。 1 つ目は、アナモキソソーム 9、カルボキシソーム 10、およびアシドカルシソーム 11 など、細胞質空間では不可能な化学プロセスを実行するために特殊な条件が維持される隔離されたコンパートメントです。原核生物の細胞小器官の 2 番目のカテゴリーは、細胞内で利用可能な表面積を増やすことによって膜依存性の代謝プロセスのスループット向上を促進する、密に詰まった膜構造、たとえばチラコイド、クロロソーム 12、およびメタン、亜硝酸塩、アンモニア酸化剤の膜構造 13 で構成されています。 14、15、16。原核生物には機能が未知の膜構造を持つ細胞小器官が含まれるため、原核生物のこれらすべての脂質構造を記述するために一般用語「細胞質内膜」(ICM) を使用します。熱力学的マージンが薄い生物や遅い化学反応を行う生物の場合、ATP 生成などの酵素活性の速度は、それらの酵素が利用できる膜表面積に比例するはずです。たとえば、一部のメタン酸化細菌では、2 つの必須代謝酵素であるメタンモノオキシゲナーゼとメタノールデヒドロゲナーゼが ICM で発見されており、これにより、潜在的に律速反応のスループットが向上すると仮説が立てられています 14,17。アンモニアでも同様のことが観察されています。アンモニア酸化細菌のモノオキシゲナーゼ15. 興味深いことに、膜タンパク質と ICM の関係は両方向にあり、膜結合型酵素を過剰発現するように細菌を改変すると、通常は細胞小器官を欠く細菌に ICM 様構造が刺激される可能性があります 18,19。

Geobacter sulfurreducens は、嫌気性環境で鉄やその他の金属を還元するグラム陰性サーモデスルホバクテリウム (以前はδ-プロテオバクテリウムとして分類されていた) です1。自然界では不溶性金属酸化物を呼吸するように適応した生物である G. sulphurreducens は、人工の固体電子受容体も呼吸することができます 2。工学的に設計されたシステムでは、この細胞外電子伝達 (EET) を利用して、測定可能な電流を生成できます。電気活性バイオフィルムのアンプリコン配列決定では、通常、接種源に関係なく、Geobacter 種が最も豊富な生物であることがわかります 20。 G. sulfurreducens は、広範囲の推定酸化還元電位 21,22 (SHE [パラジウム] に対して -0.17 [ゲーサイト] ～ +0.98 V) で電子受容体を還元し、工学的に設計されたシステムで比較的高い電流密度 (10 A もの高さ) を生成します。 m-2)23、電子伝達体の複雑なネットワークを持っています5,22,24,25。電子受容体の酸化還元電位の変化に適応するために、G. sulfurreducens は少なくとも 3 つの異なる電子伝達経路を発現し、それぞれが最適な増殖条件と明確な電気化学シグナルを持っています 3,5,22,25。これらの理由から、G. sulfurreducens は電気活性生物のモデルと考えられています 26。

G. sulphurreducens のような金属還元細菌は、比較的エネルギーが限られたニッチで活動できます。酢酸を酸化し、天然の鉄 (III) 鉱物を還元する G. sulfurreducens の酸化還元差は、ゲータイト 27 の場合、わずか 0.12 ボルトであるのに対し、好気性酢酸酸化の場合は約 1.1 V です。電気活性バイオフィルムでは、バイオフィルムの外側領域にある細胞はバイオフィルムマトリックスのインピーダンスにより実効電位が低くなるため、G. sulphurreducens は酸化還元電位の勾配を経験します 28。 G. sulfurreducens がさまざまな酸化還元条件に適応する能力は、電子伝達体の複雑なネットワークに依存します。この柔軟な代謝は膜プロセスに厳密に依存しています。 G. sulfurreducens の内膜電子伝達鎖は、細胞が利用できるエネルギー量、つまり末端電子受容体の酸化還元電位に応じて異なる電子伝達タンパク質を必要とします 5、22、29、30。酸化還元電位が低い電子受容体によってエネルギーが制限される場合、G. sulfurreducens の増殖は、ネルンスト反応速度論 28,31 による呼吸速度の低下と、呼吸電子あたりの ATP 生成収量の低下の両方によって制限される可能性があります。その影響は、膜に制限された呼吸代謝です。この制限により、低酸化還元電位の電子受容体上で増殖する G. sulphurreducens の増殖と呼吸数が減少します 29,32。

この研究では、G. sulphurreducens の ICM 構造を発見しました。私たちは、共焦点顕微鏡、プラスチックに埋め込まれた薄片透過型電子顕微鏡 (TEM)、および極低温電子断層撮影 (CryoET) を使用して、特定の細胞内領域に局在する G. sulphurreducens の ICM 構造を同定しました。さまざまな酸化還元条件で細胞を観察することにより、G. sulfurreducens の ICM は細胞が低電位で呼吸しなければならない熱力学的条件と関連しているという仮説を検証できます。これらの観察は、エネルギーが制限された条件下での呼吸の全体的な理解に重要な意味を持ちます。

プランジ凍結した細胞の凍結置換によって調製した薄いプラスチック切片では、SHEに対して-0.07 Vのアノード上で増殖させたバイオフィルムから収集したG.sulphurreducens細胞のICM構造を観察しました。 ICM は主に細胞質内の膜の平行な帯として現れ、細胞全体の一部に局在しています (図 1)。場合によっては、ICM が湾曲または円形の構造として観察されることもありました。ほとんどの場合、TEM 断面で細胞の全長が示されると、ICM は主に細胞の先端の 1 つに向かって現れました (図 1b、d)。細胞質の複数の領域で ICM を持つ細胞は見つかりませんでした。また、プラスチック切片のすべての細胞に構造の証拠があるわけでもありませんでした。より高い酸化還元電位（E'0 = 0.03 V vs SHE）を持つ可溶性電子受容体であるフマル酸塩を使用して増殖させた細胞でプラスチック切片作成手順を繰り返しましたが、得られた顕微鏡写真ではICMの証拠は見つかりませんでした（補足図1）。。

プランジ凍結、凍結置換プラスチックに埋め込まれた G. sulfurreducens の TEM 顕微鏡写真。SHE に対して -0.07 V で静置したアノードバイオフィルムから収集しました。 ICM 構造は、細胞の 1 つの領域に平行なバンドとして存在します。 a、c、および e は、長軸に垂直にスライスされたセルの ICM を示します。一方、b、d、および f は、ICM がセルの先端近くに位置する、長軸に平行にスライスされたセルの ICM を示します。顕微鏡写真は FEI TF20 で収集されました。スケールバー: 100 nm。

従来のプラスチックに埋め込まれた TEM は、細菌 ICM の特性評価に 50 年以上使用されてきました 33。 G. sulfurreducens の ICM は、他の細菌の以前に記載された構造といくつかの形態学的特徴を共有します。アンモニア酸化細菌 (AOB) は、細胞の 1 つの領域に局在する平行なバンドにしっかりと折り畳まれた 1 つの連続膜を持つ ICM を生成できますが、AOB 内の ICM は、G で観察されたものと比較して細胞体積のより大きな部分を占めるように見えます。硫黄低減剤33． AOB の ICM は内膜の陥入によって形成されます 33。 AOB Nitrosomonas eutropha では、ICM の発生はアンモニア酸化条件によって刺激されますが、ICM は無酸素脱窒中には発生しません 34。同様に、我々は、特定の環境酸化還元条件に応答して、G. sulphurreducens で ICM が生成されることを観察しました。 G. sulfurreducens では、ICM 発現を活性化するシグナル機構や、ICM の組織化に細胞骨格様タンパク質が関与しているかどうかはまだ解明されていません。

全細胞の CryoET を使用して、一般に脱水によって引き起こされるアーティファクトや膜損傷のない ICM を観察しました 35。我々は、TEM グリッド上に G. sulfurreducens を直接付着させて増殖させ、グリッド自体が電気化学セルのアノードとして機能し、その後直ちにガラス化しました。 G. sulfurreducens 細胞の再構成では、プラスチック切片 TEM で観察したものほど密集して規則的ではない ICM が表示されます (図 2、3)。 cryoET とプラスチックに包埋された薄切片 TEM の間の ICM の外観の違いは、包埋前の脱水プロセスによるアーティファクト、またはバイオフィルムの成長段階の違いに関連している可能性があります。 CryoET により、G. sulfurreducens の ICM の形態には大きな差異があることが明らかになりました。一部の細胞では、ICM は膜構造の緩やかに組織化された塊です（図 3）が、他の細胞ではより規則的で、より小さな単位で構成されています（図 2）。クライオトモグラフィーのサンプルは電気化学セルに EM グリッドを導入してから 24 時間後にのみ採取されたのに対し、プラスチック切片の TEM 画像は完全に発達したバイオフィルムから収集された細胞を捉えているため、この差異は構造の発達の異なる段階を表している可能性があります。凍結断層撮影で観察された ICM は、ほとんどの場合内膜と密接に関連しており、通常は細胞の先端近くにありました (図 2)。

a 内膜、外膜、ICM、および断層像からモデル化されたいくつかのナノワイヤを使用して、G. sulfurreducens 細胞の先端に位置する ICM の断層像セグメンテーションによって 3D モデルがどのように作成されたかを示す断層像スライス。スケールバーは100nmです。 b～d 各セルの先端付近に ICM を表示する 3 つの個別のセルの 3D モデル。これらの細胞は、-0.07 V vs. SHE でグリッド上で直接増殖させました。

陽極としてホーリーカーボン/ゴールドクライオEMグリッド上で-0.17 V vs SHEで24時間増殖させたG. sulphurreducens細胞のクライオトモグラフスライスと3Dモデル。凍結断層像は、内膜の陥入によって ICM がどのように形成されるかを示しています。上 – Z 軸で選択された断層像スライス。陥入部のセクションが表示されます。下 – モデル化されたボリュームの厚さ全体にわたる内膜と外膜の 3D モデル (左下) と、異なる深さでの ICM プロファイルを示すために Z 軸で約半分にスライスされたモデル (右下)。スケールバー: 100 nm。

タンパク質ナノワイヤーは、G. sulphurreducens の呼吸にとって重要です 36,37。私たちが収集したほとんどの低温断層像で細胞外タンパク質ナノワイヤーが観察されましたが、ナノワイヤーとICMの間に直接の関係があるかどうかは不明です（図2、補足ビデオ1〜5）。一部のナノワイヤーは ICM 位置付近で外膜と交差しますが、他のナノワイヤーは交差しません。 ICM は代謝活動の高い領域であると予想されるため、細胞外電子伝達のためのナノワイヤの位置はこの領域の近くに優先的に局在する可能性があります。

より低い電位アノード（SHEに対して-0.17）で成長させたサンプルでは、推定上の初期のICM発達段階を観察できます（図3）。 ICM は内膜の陥入によって形成されることが明らかに示されており、これは他の細菌 (例えば、Rhodobacter sphaeroides) における ICM 形成と一致しています 38,39。複雑な ICM ネットワークは明らかですが、詳細に検査すると、すべてのセクションが内部の細胞質空間と相互接続されていることがわかります。したがって、それは継続的な内膜陥入です。最も重要なことは、ペリプラズム空間が連続的であり、ICM のすべての領域から外膜への経路を提供していることです。この連続的なペリプラズム空間は、G. sulphurreducens の細胞外呼吸の代謝にとって最も重要であり、内膜からの電子は途中でペリプラズムのシトクロムを通過して細胞外に輸送されなければなりません 40,41。 G. sulfurreducens は、Lpp タンパク質が大きいため、他の細菌よりも広いペリプラズムを持つと予測されています 42。 5 つの異なる G. sulfurreducens 細胞の断層像で内膜から外膜までのペリプラズム距離を測定したところ、ペリプラズム距離は約 40 nm (95% CI [38.4,40.2]、n = 128 測定、補足図 2) であることがわかりました。別の研究で大腸菌で見つかった 30 ～ 32 nm のペリプラズム距離よりも大きい 42。

共焦点顕微鏡を使用して、G. sulfurreducens における ICM の存在を確認することもできます。同様の技術がメタノトローフの ICM を特定するために使用されています 43。さまざまなアノード電位で増殖させた固定G.sulphurreducensバイオフィルム細胞、または電子受容体としてフマル酸塩を用いて増殖させた細胞懸濁液からの共焦点画像を撮影しました。各画像には多数の個々の細胞が含まれていました（補足表1）。 ICM は、脂質選択的蛍光色素であるナイルレッドで染色すると、細胞内の局所的に明るい領域になります 44。単一の ICM を持つ細胞もあれば、複数の異なる ICM 領域を持つ細胞もあります (図 4b)。一般に、ICM は細胞の先端近くに位置しますが、細胞の長さ全体にわたる場所にも ICM が存在することを観察しました。 ImageJ プラグイン MicrobeJ45 を使用すると、ICM として識別されたセル境界とその内部の極大値を検出できます。総細胞面積に占める ICM 面積の中央値は、-0.07 V で成長させた電極バイオフィルムでは 5.7%、フマル酸塩細胞では 4.2% でしたが、部分面積には大きなばらつきがあり、30% を超える細胞もありました。 ICM が占める領域の図 (補足図 3、4)。これは、メタノトローフ生物の ICM が占める細胞面積よりも小さい 43。異なる条件から収集した細胞に同一の画像分析（ICM計数）を適用することにより、電子受容体の変化がICMを表示するG.sulphurreducens細胞の頻度に大きく影響することがわかりました（図4a）。より高い電位のアノード上で成長したバイオフィルムでは、ICM を含む細胞の割合が比較的低いことが観察されました (-0.03 V vs. SHE で 41 ± 4%、-0.17 V vs. SHE で 58 ± 8%)。フマル酸塩で増殖させた細胞は、フマル酸塩/コハク酸塩の酸化還元対が SHE に対して約 +0.03 の電位を有し、調査した最高のアノード電位と酸化還元電位が同様であるにもかかわらず、ICM の発生率が最も低かった (14 ± 10%)。しかし、バイオフィルムでは、抵抗損失と拡散制限により酸化還元電位勾配が存在します 23,46,47。そのため、フマル酸塩で増殖させた細胞は、電極上の陽極バイオフィルム細胞よりも平均してより高い酸化還元電位を経験すると予想されます。同様の可能性。アノード電位が低いと成長に必要な位置エネルギーが少なくなるため 25、ICM の存在量が増えるとエネルギー制限に適応できる可能性があります。私たちの画像解析では、細胞内の ICM を識別するために控えめなパラメーターを使用したため、ICM の絶対頻度はおそらくより高いと考えられます。

a 異なる増殖条件下での G. sulfurreducens 内の ICM を含む細胞の画分。各ドットは、平均 113 個のセルを持つ固有の画像を表します。生の数については補足表 1 を参照してください。 3 つの電位 -0.17、-0.07、および +0.07 - は、SHE に対してそれぞれの電位で構えたアノードから収集された細胞を表します。「フマル酸塩」条件の細胞は、フマル酸塩を電子受容体として浮遊増殖させた。統計的検定は、Hochberg 多重比較補正を使用した両側 t 検定で構成されました。 *(ρ < 0.05)、***(ρ ≤ 0.001)、****(ρ ≤ 0.0001)。 b -0.07 V 対 SHE の電極上で増殖させた G. sulfurreducens 細胞の共焦点 Z スタックの投影を注釈付きの ICM の例とともに合計します。 c ICMが存在しない場合の典型的な細胞形態を例示する、電子受容体としてフマル酸塩を用いて増殖させた細胞の合計投影。両方の細胞画像は、リン脂質選択的蛍光団としてナイルレッドを使用して、倍率 100 倍で撮影した大きな画像から切り取ったものです。補足図 5 の拡大挿入図を参照してください。

G. sulfurreducens は複雑かつ効率的な呼吸代謝を持っています。内膜では、電子は末端電子受容体の酸化還元電位に応じて、異なる呼吸経路に三分岐されます 3,5,22。 ICM は内膜の陥入であるため、呼吸に不可欠な内膜シトクロムを含まなければなりません。アンモニア酸化細菌とメタン酸化細菌では、律速呼吸酵素であるアンモニアモノオキシゲナーゼとメタンモノオキシゲナーゼがそれぞれ ICM 内に存在します15,17。熱力学的マージンが狭い生物の場合、ICM は膜表面積と呼吸タンパク質の総数を増加させることにより、より高い呼吸速度を可能にする可能性があります。 ICM の生成は細胞にとって多大なエネルギー投資であるはずであり、G. sulfurreducens における ICM の構造組織は、脂質貯蔵以外の特殊な機能を示唆しています。他の細菌における ICM の産生は脂質画分の上昇を引き起こすため、G. sulfurreducens が他のグラム陰性菌よりも脂質含量が高い理由は、ICM の産生によって説明されます 48。

私たちの研究では、熱力学的に好ましくない条件で増殖する細胞ではICMの発生率が高いことがわかりました（図4a）。これは、制限された条件で呼吸数を増加させるためのICMの使用と一致しています。 G. sulfurreducens の呼吸系 ICM には、細胞外電子伝達ネットワークの残りの部分に電子を渡すメカニズムが必要です。図 3 に示すように、ペリプラズムとの開いた接続がある場合、ペリプラズムのシトクロムの拡散によって電子が移動する可能性があります。 (例: PpcA、GSU1996)40,50。しかし、ICMは細胞の厚さ全体に広がり、外膜から最大200 nmの領域があるため、ICMから外膜までのこれらのシトクロムの輸送は、典型的なペリプラズム空間よりもはるかに長い距離になると考えられます。

G. sulfurreducens は ICM を持つ唯一の細菌ではありませんが、近縁な生物では ICM のようなものは見つかっていません。私たちの知る限り、これはICMを生成することが確認されたサーモデススルホバクテリオタ門の最初の生物であり、ICMを生成する最初の金属酸化物還元剤であり、バイオフィルム内に形成されるICMの最初の文書でもあります。 G. sulphurreducens の ICM は、電子受容体の酸化還元電位を変更することでその発現を簡単に制御でき、先端における ICM の極局在性は細胞内を研究する機会を提供するため、ICM 形成一般を研究する良い機会を提供します。細菌の組織。 G. sulfurreducens における ICM の産生の変化は、この構造が熱力学的および動力学的に制限された条件下で呼吸数を増加させるために自然に形成されたことを示唆しており、この仮説は他の微生物についても以前に提案されています 8。 ICM を生成する他の細菌とは異なり、G. sulfurreducens は ICM 内で呼吸経路全体を完了することができません。 G. sulphurreducens の ICM からの電子は細胞外呼吸のために外膜に移動する必要があり、それらの電子は末端電子受容体に到達する前にバイオフィルムをミクロン単位で移動する必要がある可能性があります。

G. sulfurreducens は、制限され変化する酸化還元条件下でエネルギー保存を最適化するさまざまなアプローチを持っています。特徴付けられた 3 つの経路が、エネルギー節約を最大化するために起電力性バイオフィルム内で同時に発現されるようです 51。エネルギー制限条件での ICM の生成は、細胞内でのエネルギー生成を最大化するための追加ツールであると思われます。 G. sulfurreducens の呼吸速度を予測するために使用されるネルンストモデルは、より低い電位での遅い呼吸速度を予測します 28,31,52 より遅い呼吸速度は、内膜にあると提案されている律速電子伝達タンパク質の結果です 28 ,53。 G. sulfurreducens が存在する内膜の量を増やすことによってこの律速タンパク質の量を増やすことができれば、明らかな制限が緩和され、より高い呼吸数を達成することができます。したがって、ICM がどのように使用され、どのような条件で ICM が生成されるかに関する知識は、G. sulfurreducens による電流生成速度を予測するために重要です。将来の G. sulfurreducens ICM 研究では、この生物のために開発された遺伝的ツールや創造的なイメージング技術が活用される可能性があります。

G. sulphurreducens PCA (ATCC、米国バージニア州) は、電子受容体としてフマル酸塩または電極を使用して、グリセロール冷凍庫ストックから増殖させました 25。フマル酸塩細胞は、1.5 g NH4Cl、0.6 g NaH2PO4、0.1 g KCl、2.5 g NaHCO3、0.82 g 酢酸ナトリウム、8 g フマル酸ナトリウムおよびウルフビタミンおよびウルフミネラル溶液各 10 mL を含む ATCC 1957 培地を使用した密閉嫌気培養チューブ内で増殖させました。密閉してオートクレーブ滅菌する前にガスで泡立てた水1リットルあたり。培地から酸素を除去し、pH を 7 付近に維持するために、80/20% N2/CO2 のガス混合物をすべての条件で使用しました。電極細胞は、フマル酸塩を含まない同じ培地を使用して、6 つの 100 mL 単一チャンバー微生物電気化学セルで増殖させました。 8 cm2 グラファイト電極 (Graphitestore、イリノイ州、米国) を SHE に対して -0.17、-0.07、または +0.07 V に設定しました。電流は、VMP3 ポテンショスタット (BioLogic、テネシー州、米国) で監視しました。リアクターボトルに培地を充填し、121℃でオートクレーブ処理し、その後、接種前にガスをバブリングして酸素を除去した。各反応器は、Ag/AgCl 参照電極 (BASi、インディアナ州、米国) を備えていました。

成熟バイオフィルム（生育約 30 日）からの G. sulfurreducens 細胞を、4% パラホルムアルデヒド、2% グルタルアルデヒド (v/v) を含むリン酸緩衝液で固定し、液体プロパンで急速凍結した後、2% 四酸化オスミウムで凍結置換して脱水しました。 -80 °C のドライアイス上でアセトンに溶解します。細胞をゆっくりと室温に戻し、Araldite 502 樹脂 (Ted Pella, Inc.) に包埋しました。これらの切片を 70 nm の厚さに切断し、酢酸鉛で二次染色してコントラストを向上させました。すべての薄切片イメージングは、Tecnai TF-20 (FEI) または Phillips CM12 で実行されました。

クライオET用の電極バイオフィルムセルを成長させるために、活発に成長する培養物を含む生物電気化学セルに挿入するための有窓カーボンTEMグリッド用のホルダーを設計しました。ホルダー内のグリッドは、細菌の陽極および電子受容体として機能するチタンプレートに対して保持されます。 6 nm BSA 結合金ナノ粒子フィデューシャルを乾燥させ、その後 60 °C でベーキングして、バイオリアクターに導入する前に金フィデューシャルをグリッド上に固定しました。 24時間後にホルダー内のTEMグリッドを取り外し、社内設計の手動プランジフリーザーを使用して液体窒素で冷却したエタンに直ちにプランジ凍結して、細胞を活性状態で捕捉しました（補足図6、7）。フマル酸塩条件では、7 ～ 10 日間増殖させた細胞の懸濁液を各グリッドにピペットで移し、余分な液体を除去するために吸い取り、FEI Vitrobot Mark IV で凍結させました。

凍結水和細胞は、線量対称収集スキーム 54 を使用して、Krios G2 (FEI、オレゴン州、米国) で 2.0° の角度ステップで -65° から +65° まで傾けて、個々の細胞が窓越しに観察できる領域で画像化されました。炭素。画像は、K2 Summit カメラの超解像モードで 1.8 Å ピクセルサイズの公称倍率 6500 倍、線量率 0.5 電子/Å2 * 秒、3 秒間、フレームレート 0.2 フレーム/秒 (合計) で収集されました。 Å2あたり100電子の線量）。個々のムービーフレームはゲイン補正され、MotionCor255 で位置合わせされ、合計画像が 2 ずつビニングされ、3.6 Å/ピクセルスケールの画像が得られました。合計された画像が再スタックされ、その後、eTOMO56 で断層撮影再構成が実行されました。各断層像からのスライスは、モニターのネイティブ解像度で保存される ZAP ウィンドウ保存機能を使用して IMOD から出力されました。 3D モデリングは IMOD で実行され、ChimeraX57 で視覚化されました。

電流が指数関数的に増加し始めて少なくとも 2 A/m2 になってから 12 ～ 20 日後に、G. sulphurreducens のアノードバイオフィルム細胞を再懸濁、固定し、画像化しました。 G. sulfurreducens バイオフィルム細胞を、リン酸緩衝液中で穏やかにボルテックスすることによって電極から除去し、4000 xg で 5 分間ペレット化し、4% パラホルムアルデヒドに 1 時間再懸濁し、その後すすぎ、リン酸緩衝液中に 7 ℃で保存しました。フマル酸塩条件下で増殖させた生G.sulfurreducens細胞を接種後5〜7日で画像化した。アノード条件とフマル酸塩条件の両方で細胞を 50 mM リン酸緩衝液で希釈し、ナイルレッド (ThermoFisher/Invitrogen、レッド、励起: 561 nm) で脂質染色し、最終濃度 2 μg/mL にしました。サンプルを暗所、室温で少なくとも 15 分間インキュベートしました。染色された細胞は、標準的なスライドガラス、またはマニキュア液で密封された 1 1/2 カバースリップを備えた 2% ポリ-L-リジンでコーティングされたスライドガラス上で画像化されました。

蛍光画像は、嫌気性グローブボックス内で操作され、隣接する NIS Elements ソフトウェアを使用して、100X Plan Apo λ (NA 1.45) 油対物レンズを備えた Nikon C2 + 共焦点顕微鏡で取得されました。ナイルレッドは 561 nm レーザーで励起され、525/50 561 LP フィルターキューブで濾過されました。

Z スタックは合計投影に処理され、ImageJ で平滑化するためにガウスぼかし (σ = 1) フィルターが適用されました。 ImageJ MicrobeJ プラグイン 45 は、陽極条件とフマル酸塩条件の両方で G. sulphurreducens 細胞の細菌および ICM 検出に使用され、出力の概要が補足表 1 に、分析パラメーターが補足図 8 に示されています。統計分析は、Student の t 検定を使用して実行されました。 Benjamini-Hochberg 法を使用して多重比較を補正しました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

この原稿の図を作成するために使用された断層像は、アクセッション番号 EMD-27710、EMD-27729、EMD-27748、および EMD-27747 で EMDB-EBI リポジトリにアクセスできます。

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この研究に対する資金は海軍研究局によって提供されました (ONR 賞 N0014-20-1-2269)。共焦点顕微鏡検査は、ONR DURIP 助成金 N00014-19-1-2531 を通じて取得した Nikon C2+ で実行されました。すべての電子顕微鏡検査は、ASU の電子顕微鏡コア施設で行われました。 3D モデル操作は、米国国立衛生研究所 R01-GM129325 およびサイバーインフラストラクチャおよび計算生物学局の支援を受けて、カリフォルニア大学サンフランシスコ校のバイオコンピューティング、可視化、および情報学リソースによって開発された UCSF ChimeraX を使用して部分的に実行されました。国立アレルギー感染症研究所。

アリゾナ州立大学、持続可能な工学および建築環境学校、米国アリゾナ州テンピ

イーサン・ハウリー

アリゾナ州立大学、大量輸送およびエネルギー工学部、米国アリゾナ州テンピ

アンナ・マンガス & シーザー I. タワーズ

アイリング材料センター、アリゾナ州立大学、米国アリゾナ州テンピ

デューイト・ウィリアムズ

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EH は実験を計画して実行し、図を作成し、原稿の初稿を書き、原稿を編集しました。 AM は共焦点顕微鏡検査を計画し、実行しました。 DW はクライオトモグラフィーを実行しました。 CT は資金を確保し、研究を計画し、原稿を編集しました。

セザール・I・トーレスへの往復書簡。

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転載と許可

Howley, E.、Mangus, A.、Williams, D. 他 Geobacter sulphurreducens では、熱力学的に制限された条件下で細胞質内膜が発達します。 npj バイオフィルムマイクロバイオーム 9、18 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41522-023-00384-6

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受信日: 2022 年 10 月 5 日

受理日: 2023 年 3 月 17 日

公開日: 2023 年 4 月 7 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41522-023-00384-6

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