異なる環境条件下での微生物の機能遺伝子の多様性と相互作用: 膜バイオリアクターと酸化溝からの洞察

Scientific Reports volume 6、記事番号: 18509 (2016) この記事を引用

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微生物群集の多様性と相互作用に対する環境条件の影響は、微生物生態学に対する多大な関心を引き起こしています。ここで、我々は、同一の流入水でありながら異なる運転パラメータ（主に混合液懸濁物質（MLSS）濃度、固体保持時間（SRT）、溶存酸素（DO）濃度）を使用して、オキシデーションディッチを適用した2つの本格的な都市下水処理システムを発見しました（ OD) およびメンブレンバイオリアクター (MBR) プロセスには、共有遺伝子の大部分 (87.2%) が含まれていましたが、機能遺伝子アレイ GeoChip 4.2 によって生成された 12 日間の時系列の 2 つのデータセットによって明らかになったように、全体的な機能遺伝子構造は異なっていました。ランダム行列理論 (RMT) に基づく各システムのコア炭素、窒素、およびリン循環遺伝子の関連ネットワークは、異なるトポロジー特性を示し、MBR ノードはより高い接続性を示しました。 MLSS と DO は、統計分析によってシステムの機能的な遺伝子構造を形成するのに効果的であることが示されました。 MLSS 濃度が高くなると、MBR システムのリソース利用可能性が低下し、重要な機能遺伝子の正の相互作用が促進されると考えられていました。まとめると、これらの発見は、環境条件の違いによって引き起こされるいくつかのバイオプロセスの機能的可能性の違いを示し、資源制限のストレスが高まるとMBRシステムにおける正の遺伝子相互作用が増加することを示唆します。

下水処理プラント (WWTP) は、家庭および産業廃水処理に使用されるバイオプロセス工学の最大の応用例であり、微生物コンソーシアムが中心的な役割を果たしています。システムレベルの機能（有機汚染物質の生分解と無機化、窒素とリンの循環など）と生態系の安定性は、非常に多様な微生物集団の成長、活動、相互作用を通じて達成されます。下水処理場は、化学的および物理的に明確に定義された独自の人工微生物生態系であり、生態学的に基礎的なさまざまな疑問を解決するための肥沃な実験場と考えられています1。

物理的、化学的、生物学的環境における空間的および時間的変動として定義される環境の不均一性は、生態系の基本的な特性です2。微生物群集の多様性と構成の形成におけるその役割は一般に評価されており、興味深いテーマです。下水処理場は、微生物集団、特に機能的に重要なグループの量を、システムのパフォーマンスと安定性のために通常のレベル内に維持するための適切な環境条件を提供することを目的としています。したがって、多くの研究が、主に 16S rRNA 遺伝子または特定の機能遺伝子に基づいて、微生物群集の多様性と環境条件との関係に焦点を当てています。これらは、流入水の化学的酸素要求量 (COD inf) 濃度 3、溶存酸素 (DO) 濃度 4、固体保持時間 (SRT) 5 などの差異から生じる微生物の多様性と組成の違いを明らかにします。具体的には、高い SRT で操作される固定容積バイオリアクターは、希少な資源を効率的に利用できる生物 (「K ストラテジスト」) で高度に飽和され、一方、低い SRT は、急速に成長する生物の富化に役立つことが示唆されています。高いリソース使用率に適応した (「r-strategists」)6. ニトロスピラ種、ニトロソモナス種などの一部の K ストラテジスト。プランクトミセテスおよびクロロフレクシと系統的に関連する分類群は、異なる SRT (30 日、12 日、および 3 日) およびそれに対応して異なる混合液懸濁物質 (MLSS) 濃度が設定された廃水処理システムにおいて、SRT が 12 日以上の場合にのみ存在することが示されました。さまざまな段階で適用されます5。

在庫の多様性の説明だけでは、生態系の微生物生態の全体像を把握するには十分ではありません。微生物の相互作用も微生物生態学の重要なテーマであり、これを通じて多様な群集が最も優れた種単独よりも優れたパフォーマンスを発揮できるようになります。ハイスループット技術が圧倒的な人気を博し、大量のデータが蓄積されたことにより、ごく最近、下水処理場に生息する分類群の微生物相互作用が、それらの空間的 7 および時間的 8 共起パターンを通じて明らかになりました。下水処理場の微生物生態を系統的に理解するには、環境変動が微生物相互作用に及ぼす影響を明らかにすることが必要であり、それによって技術者がそのようなコミュニティをより効率的に構築できる可能性もある。

現在、地方自治体の下水処理場は主に有機炭素、窒素、リンの除去を目的として設計されています。膜バイオリアクター (MBR) および従来の活性汚泥 (CAS) バイオリアクター (逐次バッチリアクター (SBR)、嫌気無酸素酸素 (A2O) およびオキシデーションディッチ (OD) などの改良活性汚泥プロセスを適用するシステムを含む) が一般的に適用されます。異なる操作パラメータを使用した治療プロセス。 MBR は通常、より高い MLSS 濃度、膜ろ過を備えたより長い SRT、より高いせん断力を発生させて膜の汚れを制御するためのより高い曝気強度から生じるより高い DO 濃度で運転されます。 MLSS 濃度が高くなると、食物対微生物 (F/M) 比が低くなり、資源が限られているため、MBR コミュニティはより高い栄養ストレスにさらされます。したがって、MBR の微生物の多様性と相互作用は、CAS バイオリアクターの微生物の多様性と相互作用とは異なる可能性があります。さらに、都市廃水処理のための本格的なMBRシステムとCASシステムはどちらも硝化装置のようなゆっくりと増加する個体群をサポートすることを目的としているが、特定のK戦略家は確かにSRTが長いMBRで有利になる可能性がある。 DO 濃度が異なると、微生物群集の組成に特定の違いが生じる可能性もあります。 CAS と MBR システムの微生物集団の違いに関する研究は、環境勾配と微生物生態の相関関係を理解する良い方法となるはずです。また、操作されたシステムに存在する微生物群集を特徴付けることは、システムの機能を理解するのに有益です。

既存の研究は、分類学的構造の差異9,10と、CASおよびMBRシステムの特定の機能遺伝子（硝化遺伝子および脱窒遺伝子など）の多様性に光を当てています11。しかし、システムプロセスに関連する微生物の機能的可能性に直接取り組むためには、代謝経路、エネルギー論、制御回路に関連する構造遺伝子など、より多くのカテゴリーの微生物の機能的特徴を調べることが重要です12。微生物の多様性は別として、MBR システムにおける微生物の生態学的相互作用はこれまで報告されておらず、生態系の可能な微生物の相互作用が基質の利用可能性の勾配によってどのように異なるかについての解釈は言うまでもなく、報告されていません。

この研究では、同一の流入水を使用する 1 つの廃水処理プラントで並行して稼働する 2 つの本格的な MBR および OD システムに焦点を当てました。中国住宅都市農村開発省が発行したデータによると、2013年末までに、OD技術は中国の都市下水処理場（MWTP）で最も広く使用されている処理プロセスとなった（26.7％を占めている）。数的に）。 OD システムの累積処理能力は、A2O システム (36.5%) に次いで、中国で第 2 位 (25.2%) にランクされています。 2 つの処理システムの調査は、環境勾配と微生物生態の相関関係だけでなく、本格的な MWTP の機能を理解するためにも重要です。各システムについて、毎日 12 個の連続したサンプルが収集され、包括的な機能遺伝子マイクロアレイ – GeoChip 4.2 を使用して、各サンプルの微生物の機能的可能性に直接関連する全体的な機能遺伝子の多様性が分析されました。機能的な遺伝子相互作用の可能性は、ランダム行列理論 (RMT) アルゴリズムを使用した関連ネットワーク構築を通じて明らかにされました 13。私たちが取り組む具体的な科学的問題は次のとおりです。(1) MBR および OD システムの機能的遺伝子の多様性と構成は何か。 (2) 各システムの重要な機能遺伝子がどのように関連している可能性があるか。 (3) 環境変数が機能遺伝子全体の一時的な集合パターンにどのように影響するか。我々は、これが機能的遺伝子多様性の差異と、MBRおよびODシステムの微生物相互作用の可能性を明らかにする最初の研究を提示すると信じている。また、環境条件が微生物界の生態に与える影響についての有益な洞察も得られます。

2 つのシステムは同一の都市廃水を処理しました。 2 つのシステムの処理プロセスと環境条件の違いは、オンラインの補足表 S1 に示されています。 COD inf 濃度は 399.4 ± 77.7 mg/L でした。流入水の全窒素 (TN inf) 濃度は 44.2 ± 5.9 mg/L でした。流入水の総アンモニア (NH4 + -N inf) 濃度は 34.1 ± 5.4 mg/L、流入水の総リン (TP inf) 濃度は 5.1 ± 1.3 mg/L でした (オンライン補足表 S2)。バイオリアクター MBR システムの pH、温度、DO 濃度はそれぞれ 6.92 ± 0.07、19.1 ± 0.7 °C、2.95 ± 0.46 mg/L で、OD システムの OD 濃度は 7.05 ± 0.10、19.3 ± 0.7 °C、1.69 ± 0.51 でした。それぞれ mg/L (オンライン補足表 S3)。 OD システムの MLSS 濃度は約 4,500 mg/L に維持され、MBR システムの MLSS 濃度は約 7,000 mg/L に維持されました。 MBR システムの SRT は約 20.5 日、OD システムの SRT は約 16.2 日でした。 2 つのシステムは比較的安定した処理効率を示しました。 MBR システムはより高い COD 除去効率を示しましたが、OD システムはより優れた TN 除去性能を示しました (オンライン補足表 S3)。

合計 36,420 個の機能遺伝子が検出され、そのうち 35,060 個の遺伝子が OD システムに存在し、33,117 個の遺伝子が MBR システムに存在しました。遺伝子は、炭素循環、窒素循環、リン循環、細菌ファージなどの 16 のバイオプロセスに関与していました。 α多様性指数 (表 1) は、2 つのシステムが高い機能的遺伝子多様性を持ち、OD システムがより高い微生物多様性を示すことを示唆しました。機能遺伝子の大部分 (87.2%) は、各カテゴリーに含まれる 2 つのシステムで共有されていました。遺伝子が共有されているにもかかわらず、各システムは、各カテゴリーに関連付けられたいくつかの固有の遺伝子を持っていました。 MBR システムにのみ存在する遺伝子は 3.7% を占め、OD システムの値は 9.1% でした。

2 つのシステムは、機能遺伝子の各カテゴリーの同様の相対存在量分布を示しました。 OD システムは、細菌ファージ (p < 0.05、コーエンの d の絶対値 = 0.89)、窒素循環 (p < 0.001、コーエンの d の絶対値 = 1.31)、およびリン利用 (p < 0.05、コーエンの d の絶対値 = 0.99) (図 1a)。

特定のバイオプロセスに関与する機能遺伝子の相対的な存在量。

(a) 機能遺伝子の各カテゴリー、(b) 炭素循環遺伝子の各サブカテゴリー、(c) 窒素循環遺伝子の各サブカテゴリー、(d) リン利用遺伝子の各サブカテゴリー。エラーバーは、同じシステムからの 12 個のサンプルにおける遺伝子の各カテゴリーまたはサブカテゴリーの相対存在量の標準偏差を表します。反復測定分散分析 (ANOVA) によって示されるシステム間の有意な差は、バーの上のアスタリスク、「*」 (P < 0.05)、「**」 (P < 0.01)、「***」 (P < 0.01) で示されます。 0.001）。

2 つのシステムの機能的潜在的分化の詳細を明らかにするために、炭素、窒素、およびリン汚染物質の除去がシステムの主なタスクであるため、我々は 3 つの重要な機能的遺伝子カテゴリー (炭素循環、窒素循環、およびリン利用) の多様性に焦点を当てました。 MWTP。

炭素循環に関連する遺伝子は合計 4,129 個検出され、そのうち 3,976 個の遺伝子が OD システムに存在し、3,735 個の遺伝子が MBR システムに存在しました。そのうち、炭素分解遺伝子が優勢であり、76.6%を占めた。これらの遺伝子は、デンプン、セルロース、キチンなどのいくつかの多糖類の除去に役割を果たしました。炭素分解遺伝子は、OD システムよりも MBR システム内でわずかに豊富でした（p < 0.05、コーエンの d = 0.95）（図 1b）。

窒素循環に関連する遺伝子は合計 2,983 個検出され、その内訳はアンモニア化 (12.9%)、硝化 (14.2%)、脱窒 (43.4%)、アナモックス (0.2%) およびその他 (29.3%) に関与する遺伝子でした。検出された 424 個の硝化遺伝子は、408 個の amoA 遺伝子と 16 個の hao 遺伝子で構成され、そのうち 55.9% は Pseudomonas putida などの推定従属栄養性硝化菌由来でした。さらに、硝化遺伝子の 11.3% は、下水処理場で一般に知られているアンモニア酸化細菌 (AOB) であるニトロソモナス (7 遺伝子)、ニトロソスピラ (15 遺伝子)、およびニトロソビブリオ (1 遺伝子) を含むニトロソモナス目由来のものでした。ニトロソスピラ由来の遺伝子は、MBR 内で相対存在量がわずかに高く (p < 0.05、コーエンの d の絶対値 = 0.88)、相対存在量の変化率は 8.3% でした。また、硝化遺伝子の18.4％を占める古細菌の遺伝子も検出された。脱窒に関連して検出された 1,295 個の遺伝子のうち、88.5% が非培養分離株由来でした。 OD システムの脱窒遺伝子の相対存在量は、MBR システムよりわずかに高かった (p < 0.01、コーエンの d の絶対値 = 1.09) (図 1c)。

リン利用に関連する遺伝子は、ppk 遺伝子 (37.3%)、ppx 遺伝子 (57.6%)、フィターゼ遺伝子 (5.1%) など、合計 528 個検出されました。ポリリン酸キナーゼ（ppk）はポリリン酸（polyP）合成に関与しており、ppk遺伝子は2つのシステム内の相対存在量に有意な差を示さなかった（図1d）。エキソポリホスファターゼ (ppx) は、長鎖ポリ P の末端残基からリン酸 (Pi) への嫌気性加水分解プロセスを触媒する非常に進行性の酵素です。 ppx遺伝子の相対存在量は、MBRシステムよりもODシステムの方が有意に高かった（p < 0.001、コーエンのdの絶対値 = 1.39）（図1d）。フィターゼは、植物の種子や花粉におけるリンの主な貯蔵形態であるフィチン酸塩からのリン酸塩の段階的放出を触媒します14。フィターゼ遺伝子は、OD システムよりも MBR システム内の相対存在量がわずかに高かった（p < 0.05、コーエンの d = 0.96）（図 1d）。

ノンメトリック多次元尺度法 (NMDS) の結果から、各システムのサンプルがグループ化されていることが明らかになりました (図 2)。さらに、非類似性試験により、2 つのシステムが全体的な機能遺伝子、炭素分解遺伝子、窒素循環遺伝子、およびリン循環遺伝子の異なる構造を示すことが示されました (表 2)。マントルテストでは、汚染物質（COD、TN、NH4 + -N）の除去効率と全体的な機能遺伝子構造の間に有意な相関関係は示唆されませんでした。システムのリン除去は単に生物学的プロセスに依存していないため、分析を行う際、リン除去効率は機能的な遺伝子構造に直接関連付けられませんでした。

調査された 24 のサンプルにおける微生物群集の全体的な機能遺伝子の非計量多次元尺度法 (NMDS) 分析。

同じ廃水処理システムからのサンプルをグループ化しました。

各システムでは、サンプルは NMDS プロットで明らかなパターンを示さず、機能遺伝子の各カテゴリの存在量は 12 日間でわずかな変動を示しました (図 1)。これは、機能遺伝子全体の明らかな毎日の連続が存在しないことを示しています。

標準対応分析 (CCA) を実行して、SRT、MLSS 濃度、DO 濃度、バイオリアクターの pH および温度、COD inf 濃度、NH4 + -N inf 濃度、 TN inf 濃度と TP inf 濃度。 SRT は、分散膨張係数 (VIF) 値によって冗長な因子として評価され、MLSS 濃度が存在する場合には除外されました。最初の 2 つの順序軸に沿って配置された機能遺伝子全体と残りの環境変数の CCA 順序バイプロットは、軸が環境変数スコアの線形結合になるように制約することによって生成されました (図 3)。 MLSS と DO は、CCA プロットにおける 2 つのシステムの全体的な機能遺伝子構造を形成する有効な因子であると評価されました。マンテルテストの結果は、全体の機能的遺伝子構造とMLSS (r = 0.4281、P = 0.001)、SRT (r = 0.4281、P = 0.001)、DO (r = 0.2795、P = 0.001)との間に有意な関連性があることを示しました。機能的遺伝子構造と廃水の特性およびバイオリアクターの温度と pH の間に有意な相関関係はマンテルテストによって明らかにされませんでした (データは示されていません)。

全体的な機能遺伝子のシグナル強度と環境属性の正準対応分析 (CCA)。

軸 1 と軸 2 の説明された累積変動量は、それぞれ 43.3% と 12.0% でした。

各システム内で多数の遺伝子が共存していることがわかりました。 OD システムでは、12 の毎日のサンプルすべてに 50.9% の遺伝子が存在しました。 MBR システムの場合、値は 47.6% でした。各システムの 12 サンプリング日における共存遺伝子の詳細情報は、オンラインの補足表 S4 に示されています。私たちはこれらの共存遺伝子が各システムの中核となる機能遺伝子であると考えています。炭素、窒素、リンの循環に関与するこれらのコア遺伝子の相互作用の可能性が、RMT アルゴリズムに基づくネットワーク構築によって明らかになりました。その結果、MBR システムでは 1,116 ノードと 1,741 リンク (ネガティブ 4.2%、ポジティブ 95.8%) のネットワークが得られ、OD システムでは 1,426 ノードと 1,462 リンク (ネガティブ 9.4%、ポジティブ 90.6%) のネットワークが得られました。

2 つのネットワークは、スケールフリー、スモールワールド、モジュール性など、生態学的ネットワークの一般的なトポロジー的特徴を示しました (補足テキスト S1 オンライン)。 2 つのネットワークのトポロジ構造は、平均測地線距離、平均クラスタリング係数、モジュール性、推移性など、大きく異なりました (表 3)。 MBRネットワークの平均接続性、平均クラスタリング係数、推移性はODネットワークよりも高かった。各ネットワーク内で接続性が上位 5 位にランクされたノード間のリンクを図 4 に示します。2 つのネットワークで共有されていたノードは 22.0% (458) のみでした。対応のある t 検定によって明らかになったように、2 つのネットワーク内のこれらの共有ノードの接続性 (p = 9.51 × 10−6) とクラスタリング係数 (p = 2.19 × 10−8) に有意な差が観察されました。

2 つのシステムにおける主要な機能遺伝子の異なるネットワーク相互作用。

(a) MBR システム内で接続性が上位 5 位にランク付けされた機能遺伝子のネットワーク相互作用。 (b) OD システムで接続性が上位 5 位にランクされた機能遺伝子のネットワーク相互作用。ノードの色は、異なる機能遺伝子を示します。青い線は 2 つのノード間の正の相互作用を示し、赤い線は負の相互作用を示します。この図のノードは、炭素循環、窒素循環、およびリン利用に関連する遺伝子です。

MBR ネットワーク内で 200 個のモジュールが検出され、OD ネットワーク内で 295 個のモジュールが検出されました。各モジュールには、機能遺伝子のさまざまなカテゴリーまたはサブカテゴリーが含まれていました。各ネットワークについて、ほとんどのノードは周辺ノードとして評価されました。周辺ノードは、ほとんど常にモジュール内のノードへのリンクを少数しか持たず、生態学の観点から専門家を表します。各システムでモジュールハブとして定義されているノードはほとんどなく、それぞれのモジュール内の複数のノードに高度に接続されていました。 MBR ネットワークでは、炭素分解 (66.7%)、硝化 (8.3%)、脱窒 (8.3%)、窒素固定 (8.3%) および異化的 N 還元 (8.3%) に関与する遺伝子からなる 12 個のモジュールハブが検出されました。 OD ネットワークでは、炭素分解 (37.5%)、炭素固定 (12.5%)、リン利用 (18.8%)、脱窒 (12.5%)、窒素固定 (12.5%) に関連する遺伝子からなる 16 個のモジュールノードが検出されました。および非類似性 N の減少 (6.3%)。 MBR ネットワーク内では、窒素アンモン化に関連するコネクタ (複数のモジュールに高度にリンクされている) が 1 つだけ検出され、OD ネットワーク内ではコネクタは検出されませんでした。エコロジーの観点から見ると、モジュールのハブとコネクタはジェネラリストです。 2 つのネットワークのモジュールハブやコネクタはどれも同じではありませんでした。各ネットワークのモジュールハブとコネクタの詳細は、オンラインの補足表S5に示されています。

各ネットワークについて、ノードの接続性と 7 つの環境変数 (DO、バイオリアクターの pH および温度、COD inf、NH4 + -N inf、TN inf、および TP inf) の間の関係を調べました。 OD ネットワークでは、環境変数の遺伝子有意性 (GS) はいずれもノード接続性と有意な相関を示しませんでした。 MBR ネットワークでは、バイオリアクターの pH の GS はノードの接続性と弱いつながりを示しました (オンラインの補足表 S6)。

2 つのシステムの全体的な機能遺伝子の高い類似性が検出されました。廃水由来の有機および無機汚染物質 (PO43- や重金属など) の除去は、いくつかの重要な微生物グループの共存と特定の微生物種の発生に大きく依存していることが知られています 7,15。 2 つのシステムはどちらも有機炭素、窒素、リンの汚染物質を除去するように設計されています。いくつかの重複した機能遺伝子が、両方のシステムの各バイオプロセスに関与している可能性があります。さらに、OD システムからの接種材料スラッジは、MBR システムの起動に使用されました。元の MBR 集団は OD コミュニティから提供されました。また、異なる流入水を受けるシステムの集団と比較して、バイオリアクターコミュニティは基質組成と供給源コミュニティの違いから免除されるため、同一の廃水はコミュニティの類似性を促進します。さらに、廃水と場所が同一であるため、バイオリアクターの温度と pH が同様になり、地域社会に同様の物理化学的条件が提供されました。デンマークの従来の強化生物学的リン除去 (EBPR) および MBR プラントでも同様の結果が得られ、16S rRNA 遺伝子の大部分が共有されることが示されました 10。

ただし、2 つのシステムの機能遺伝子の特定のカテゴリーおよびサブカテゴリーの存在量にはわずかな違いが示されました。これらは、これら 2 種類の処理プロセスに共通する環境条件の違いから生じる可能性があります。 MBR は CAS システムよりも優れた消毒能力を備えていることが示唆されています 16。 MBR におけるファージの除去は主に、膜表面上のバイオフィルムの蓄積によって達成されることが示唆されており、これにより物理的に膜の孔径が減少し、ファージが化学的に吸着され、他の微生物によるファージの生物学的捕食が可能になります。したがって、膜タンクの MLSS (MBR サンプル) 内の細菌ファージは存在量が少ない可能性があり、OD サンプルの細菌ファージよりも存在量が少ない可能性があります。 MBR システムの SRT が長くなると、多糖やタンパク質などの高分子量化合物の分解に関与する一部の微生物が濃縮される可能性があります 18。さらに、MBR システム内の MLSS の濃度が高いと、コロイド状物質の濃度が増加する可能性があり、これらの化合物を除去できる微生物にとって新しい供給源となります。これは、MBR システムの膜タンクの上澄み中の多糖類の濃度 (2.4 ～ 6.5 mg/l) が OD システムの曝気タンクの上澄みの多糖類濃度 (1.3 ～ 5 mg/l) よりも高かったという事実によって確認されます。 2011年4月から2012年3月まで（未発表データ）。したがって、炭素分解遺伝子は、MBR サンプル内でより豊富に存在する可能性があります。窒素循環遺伝子の存在量の違いについては、以下の理由が考えられます。ニトロソモナスと比較して、ニトロソスピラは比較的低濃度の基質下で優先されることが示唆されているため、MBR システムにおけるニトロソスピラの硝化遺伝子の存在量が高いことは、F/M 比が低いことに起因する可能性があります 19。 OD システム内の脱窒遺伝子の存在量が多いのは、DO 濃度が低く、F/M 比が高いためである可能性があります。前者は脱窒を促進する可能性があり、後者は脱窒者がより容易に生分解可能な炭素源にアクセスできるようにする可能性があります。リン利用遺伝子の存在量の違いについて考えられる説明を以下に挙げます。 OD システム内の ppx 遺伝子の存在量が多いのは主に DO 濃度が低いことに起因すると考えられ、これは長鎖ポリ P の末端残基のリン酸 (Pi) への嫌気的加水分解プロセスに利益をもたらす可能性があります。フィターゼは細菌細胞のバランスのとれた増殖には必要ではないが、栄養素またはエネルギーの制限に応じて合成される可能性があることが示唆されています20。 MBR システムのフィターゼ遺伝子の存在量がより多いのは、MBR コミュニティが直面した栄養またはエネルギーの制限というより厳しい状況によるものである可能性があります。特定の機能遺伝子群の存在量におけるこれらの顕著な差異（たとえば、MBR システムでは炭素分解遺伝子がより豊富に存在し、OD システムでは脱窒遺伝子がより豊富に存在する）は、特定のバイオプロセスの機能的可能性に対する環境勾配の特異的な影響を明らかにしました。これらは、COD と TN の除去において観察されたシステムパフォーマンスの違いをある程度説明できる可能性があります。 2 つのシステムの機能遺伝子全体の構造の違いと、機能遺伝子の特定のカテゴリーも明らかになりました。これは、各システムの固有の遺伝子の存在と、特定の遺伝子の豊富な差異に起因すると考えられます。しかし、システム機能と全体的な機能遺伝子構造との間に有意な関連性は検出されなかった。考えられる理由は、各システムの固有の機能遺伝子または存在量の異なる遺伝子が COD、TN、および NH4+ -N の除去とそれほど密接に関連していない可能性があることです。

機能的遺伝子の存在量と構造の区別に加えて、MBRネットワークのより高い平均接続性、平均クラスタリング係数、推移性、および正の相互作用パーセンテージによって、MBRコミュニティ内のより緊密な相互作用/共役、特により緊密なポジティブ（促進的）相互作用が示唆されました。これは、MBR システムの炭素、窒素、リンの基質の F/M 比が低いことに起因する可能性があります。 MBR集団にとって、近隣住民との協力による基質不足のストレスの改善は良い選択かもしれない。例えば、炭素分解基は、脱窒剤として容易に分解可能な有機炭素の利用可能性を高める可能性がある。したがって、有機炭素分解集団と脱窒剤は、OD システムよりも MBR の方が密接に結びついている可能性があります。同様に、植物の資源によって引き起こされる中程度のレベルのストレスでは、促進が主要な最終結果であると予想でき21、中程度の降雨ストレスでは植物種間の正の相互作用が優勢であることが注目されました22。 2 つのネットワーク内でジェネラリストノードの重複は検出されず、MBR および OD システムのモジュール内またはモジュール間で重要な役割が異なるノード (遺伝子) によって演じられていることを示しています。

CCAは、MLSSとDOが2つのシステムの機能的な遺伝子構造を形成する主な要因であることを明らかにし、それはマントルテストによって検証されました。上で論じたように、MBR システムの MLSS が高く、その結果 F/M 比が低くなると、ニトロソスピラのような K ストラテジストが有利になり、MBR システムで脱窒物質を選択し、フィターゼ遺伝子を促進する可能性があります。また、上清の多糖類が増加し、これが MBR システムの炭素分解遺伝子の存在量の増加に寄与している可能性があります。 MBR システムの通気率が高いと、脱窒物質や ppx 遺伝子が選択される可能性があります。 CCA を行う際の SRT 濃度と MLSS 濃度の間の数値相関により、MLSS が存在する場合には SRT は冗長変数として評価されず、CCA プロットから除外されました。一方、マンテルテストにおける SRT と機能遺伝子構造との有意な相関は、SRT が機能遺伝子構造に何らかの影響を与える可能性があることを示しています。具体的には、上で議論したように、MBR システムの SRT が長いほど、多糖類を分解できる一部の生物、たとえば Chloroflexi の促進に役立つ可能性があります 5,23。これは、炭素分解遺伝子がより豊富に存在することの説明になる可能性があります。以前の研究では、短い SRT が下水処理場の微生物群集に影響を与えることが示されています。 3 日の SRT で操作されたシステムには、ニトロスピラ属が存在しないことが示されました。ニトロソモナス sp.5。 10 日、3 日、および 5 日の SRT で操作された別のシステムでは、SRT が高い場合に微生物集団がより多様になることが示されました24。しかし、2つのシステムのSRTが異なっていても、硝化遺伝子存在量の有意な差は生じませんでした（図1c）。考えられる理由は、2 つのシステム (20.5 日と 16.2 日) の SRT が両方とも硝化剤の増殖を可能にする可能性があることです。機能的な遺伝子構造に対する操作パラメーターの影響に加えて、2 つのネットワークにおける共有ノードの割合が低いこと、異なるトポロジー構造、およびノードの異なるトポロジー的役割は、操作パラメーターの差異が 2 つのシステムの考えられる微生物相互作用も変化させることを示しました。 MBR システムの MLSS が高いと、資源制限ストレスが増加し、したがって、炭素、窒素、リンの循環に関連する機能遺伝子間の正の相互作用が増加する可能性があります。 2 つのシステムにおける機能遺伝子の多様性と相互作用に対する処理プロセスと環境変数の考えられる影響は、オンラインの補足表 S1 にまとめられています。

廃水の特性、バイオリアクターの温度と pH は、流入水の変動の影響を受けやすいため、全体的な機能遺伝子構造の形成に比較的小さな役割を果たしました。さらに、これらの変数と各ネットワークのトポロジーの間に重大なリンクがないか、わずかな弱いリンクしかなく、微生物の相互作用の可能性には影響を及ぼさないことが明らかになりました。その理由は、2 つのシステムの廃水特性の変動が小さく、サンプリング期間中の温度と pH が基本的に安定していたためと考えられます。さらに、いくつかの未測定の影響力のある変数も、機能遺伝子の多様性の重大な変化に寄与し、各システムにおけるコア機能遺伝子の可能な相互作用に影響を与える可能性があります。

長期間のサンプリングが実施される場合、バイオリアクターの温度や pH など、他のパラメーターのより大きな勾配がカバーされます。微生物の生態に影響を与える主な環境変数は異なる場合があります。ハイスループットシーケンスを使用した単一の下水処理場に関する長期調査では、4 年以上の期間で存在量が大幅に変化する属の季節動態を推進する上で、温度と塩分が重要であることが示されました 25。別の研究では、環境要因と下水処理場におけるいくつかの永続的な運用分類単位 (OTU) の間に強い相関関係がないことが示されました。環境条件（主に SRT と無機窒素）は系統発生の差異を部分的に説明し、細菌の集合に間接的に影響を与えました8。これらの研究は、微生物群集構造を形成する有効な変数がケース固有である可能性を示唆しています。しかし、MBR および活性汚泥システムのコミュニティに関する長期的な調査はほとんど報告されていません。このような研究では、観察された微生物の多様性の差異をもたらす上でどの変数が優勢であるかについても議論されていません 11。大きな環境勾配を伴う微生物生態と環境勾配との相関関係についての深い議論を可能にするために、さらなる研究によってMBRおよび活性汚泥システムの群集の長期時系列サンプリング（たとえば、毎月、季節、毎年）を実施することが提案されています。物理化学パラメータと操作パラメータの両方がカバーされています。

要約すると、この研究では、並行して動作する 2 つの MBR および OD システムの動作パラメーター (MLSS、SRT、および DO) の違いが、特定のバイオプロセスの機能的潜在力だけでなく、微生物の相互作用にも実際に影響を与えることを示しました。これらの発見は、異なる環境条件が微生物の生態に及ぼす影響についての有用な洞察を与えてくれます。下水処理場はよく管理された微生物の生態系ですが、私たちが知っているのはその氷山の一角だけです。重要な生態学的問題への答えと、システムのより良い設計と運用のためのシステムの理解を目的とした、これらのシステムに関するさらなる研究は非常に重要です。

2 つの本格的な廃水処理施設は、中国の江蘇省無錫の下水処理場にあります。それらの 1 つは経口 OD であり、もう 1 つは嫌気-無酸素-酸素プロセスと組み合わせた MBR (A2O-MBR) です。彼らは同一の廃水 (家庭用: 工業用 = 0.6 : 0.4) を同じ規模 (50,000 m3/日) で処理しており、MBR スラッジには元々 OD スラッジが接種されていました。システムの有機炭素および窒素汚染物質の除去は生物学的プロセスによって達成され、それらのリンの除去は生物学的プロセスと化学的沈殿の両方によって行われました。それらは、サンプリング前に少なくとも 1 年 3 か月間、良好な処理効率と安定性を持って運用されていました 26,27。

MLSS サンプルは、2011 年 4 月 10 日から 21 日まで連続 12 日間、1 日 1 回、OD システムの好気ゾーンと A2O-MBR システムの膜タンクから採取されました。毎日、各回で 50 ml の MLSS が収集されました。サイト。各サンプルを 50 mL の滅菌エッペンドルフチューブに分注し、14,000 g で 10 分間遠心分離しました。ペレットは分析のために-80℃で保存されました。毎日の測定は、流入水と流出水の 24 時間複合サンプルの汚染物質濃度と、各システムの曝気ゾーンの温度、pH、および DO 濃度を決定するために行われました。 MLSS 濃度と SRT のおおよその値は工場スタッフから提供されました。

微生物のゲノム DNA は、前述のように凍結と細胞溶解のためのドデシル硫酸ナトリウム (SDS) の組み合わせによって活性汚泥サンプルのペレットから抽出されました 28。次いで、抽出された生成物を、Wizard（登録商標）SV Genomic DNA Purification Kit（Promega、ウィスコンシン州マディソン）を使用して精製した。

1 μg の DNA を前述のように標識、精製、乾燥させました 29。標識されたすべての DNA を前述のとおり 30 10 μL ハイブリダイゼーション溶液に再懸濁し、MAUI ハイブリダイゼーションステーション (BioMicro、ソルトレイクシティ、ユタ州、米国) で GeoChip 4.2 と 42℃、40% ホルムアミドで 16 時間ハイブリダイズさせました。マイクロアレイは、ScanArray 5000 マイクロアレイ分析システム (PerkinElmer、米国マサチューセッツ州ウェルズリー) により 100% レーザー出力でスキャンされました。

スポットのシグナル強度は、ImaGene 6.0 (Biodiscovery Inc.、米国カリフォルニア州エルセグンド) で測定しました。データの前処理はオンラインで実行されました (ieg.ou.edu)。各サンプル中の好熱菌プローブ (陰性対照) の割合は、低品質のスポットを除去することにより 5% 未満になりました。潜在的なノイズを避けるために、同じシステムからの 12 サンプルのうち 3 つ以下のサンプルでのみ検出された遺伝子が削除されました。次に、各サンプルについて、遺伝子の強度を自然対数形式に変換し、平均シグナル強度で割りました。

検出された遺伝子とそのシグナル強度の詳細情報は、Gene Expression Omnibus (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/、アクセッション番号 GSE 67307) で入手できます。

微生物群集の非類似性を明らかにするために、ノンパラメトリック多変量分散分析 (ADONIS)、類似性分析 (ANOSIM)、多重応答順列手順 (MRPP) を含む 3 つのノンパラメトリック多変量統計検定と NMDS 分析が実行されました。 2 つのシステムにおける各機能遺伝子カテゴリーおよび特定のサブカテゴリーまたは系統グループの多様性指数と存在量が異なるかどうかをテストするために、反復測定分散分析 (ANOVA) を実行しました。コーエンの d は治療効果の大きさを評価するために適用され、従来のルールではコーエンの d が 0.8 であるとみなされるため、対照群の 79% が実験群の被験者よりスコアが低いことが示唆されています 31,32。全体的な機能群集構造に対する環境要因の影響を評価するために、CCA とマンテルテストが実行されました。 CCA では、各環境属性の VIF を使用して、説明変数間の多重共線性が特定されました。 VIF 値が 20 を超える係数は、冗長な制約とみなされ、削除されました。上記の統計分析はすべて R コード (http://www.r-project.org/) を使用して行われました。

炭素、窒素、およびリンの循環に関連する遺伝子の微生物相互作用の可能性を明らかにするために、包括的な分子生態学的ネットワーク解析パイプライン (MENAP) (http://ieg2.ou.edu/MENA/) を使用して、RMT に基づいて 2 つの微生物関連ネットワークが構築されました。 )13. 「時系列のピアソン相関（1 時点の遅れを許容）」の類似度行列が適用されました。各システムについて、12 週間のサンプルすべてで検出された遺伝子 (多数決) のみがネットワーク構築のために保持されました。このフィルタリングステップにより、あまり表現されていない機能遺伝子が除去され、ネットワークの複雑さが軽減されました 33。各ネットワークについて、ネットワークサイズと平均リンク数が同じで、対応する 100 個のランダムネットワークが生成されました。 Z 検定は、構築されたネットワークとランダムネットワーク間のインデックスの違いをテストするために使用されました。モジュール性の特性を特徴付けるために、各ネットワークは、高速な貪欲なモジュール性最適化によってモジュールに分離されました。さまざまなノードのトポロジー的役割は、モジュール内接続性 (zi) およびモジュール間の接続性 (Pi) によって次の 4 つのサブカテゴリーに分割されました。 (ii) コネクタ。 (iii) モジュールハブ。 (iv) ネットワークハブ34。異なるシステムのネットワークインデックス間の比較には、対応するランダムネットワークから得られた標準偏差を使用して Student t 検定を使用しました。 2 つのネットワークの共有ノードのトポロジー構造を比較するために、対応のある t 検定が実行されました。微生物ネットワークトポロジーと環境特性の間の関係は、GS とノードの接続性の間の相関を測定することによって間接的な方法で調べられました12。 Cytoscape_3.2.1 はノードのネットワーク視覚化に使用され、その接続性は上位 5 位にランクされました。

この記事を引用する方法: Xia, Y. et al. 異なる環境条件下での微生物の機能遺伝子の多様性と相互作用: 膜バイオリアクターと酸化溝からの洞察。科学。議員6、18509; 土井: 10.1038/srep18509 (2016)。

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最終原稿の英語の書き方を改善してくださったデュイスブルク・エッセン大学の Wolfgang Sand 博士に感謝します。この研究は、NSFC (51178239) および環境シミュレーションおよび汚染制御の州主要共同研究所 (14L03ESPC) の特別基金によって支援されました。

環境シミュレーションと汚染制御国家主要共同研究所、清華大学環境学部、100084、北京、中国

Yu Xia、Man Hu、Xianghua Wen、Xiaohui Wang、Yunfeng Yang、Jizhong Zhou

環境ゲノミクス研究所および植物微生物学部、オクラホマ大学、オクラホマ州、米国ノーマン

周吉忠

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YX は GeoChip データの統計分析を行い、原稿の草稿を書きました。 MH は DNA 抽出とデータの前処理を行いました。 Xianghua Wen は実験設計者の 1 人であり、データ分析を監督し、原稿を修正しました。 Xiaohui Wangは、サンプリング、環境データ測定、GeoChipハイブリダイゼーションを実施しました。 YFY はデータ分析と原稿修正についていくつかの提案を行いました。 JZZ は実験の設計を支援し、GeoChip 4.2 のツールを提供しました。

著者らは、競合する経済的利害関係を宣言していません。

この作品は、クリエイティブコモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされています。この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、クレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブコモンズライセンスに含まれています。素材がクリエイティブコモンズライセンスに含まれていない場合、ユーザーは素材を複製するためにライセンス所有者から許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

Xia、Y.、Hu、M.、Wen、X. 他。異なる環境条件下での微生物の機能遺伝子の多様性と相互作用: 膜バイオリアクターと酸化溝からの洞察。 Sci Rep 6、18509 (2016)。 https://doi.org/10.1038/srep18509

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受信日: 2015 年 8 月 26 日

受理日: 2015 年 11 月 19 日

公開日: 2016 年 1 月 8 日

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