N を使用したアナモックスの種分化とバイオフィルム付着戦略の制御

Scientific Reports volume 12、記事番号: 21720 (2022) この記事を引用

645 アクセス

1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

廃水処理における従来の窒素除去には、大量の酸素とエネルギーの投入が必要です。嫌気性アンモニウム酸化 (anammox) は、アンモニウムと亜硝酸塩を 1 段階で窒素ガスに変換するもので、よりエネルギーとコスト効率の高い代替手段であり、側流廃水処理に広く適用されています。種の多様性と生理学がよりよく理解されれば、それは主流の治療選択肢となるでしょう。アナモックス細菌は、段階的な亜硝酸塩およびアンモニア濃度の増加 (R1)、一酸化窒素の補充 (R2)、または複合有機炭素のいずれかを使用した標準的な濃縮条件下で、単一の接種材料から相対存在量で最大 80%、90%、および 50% まで濃縮されました。それぞれ主流廃水（R3）から。 Candidatus Brocadia caroliniensis がすべての反応器で優勢でしたが、Ca への移行が見られました。 Brocadia sinica は、アンモニウムと亜硝酸塩の濃度がそれぞれ 270 mg NH4-NL-1 および 340 mg NO2-NL-1 を超える場合に発生しました。 NO が存在すると、従属栄養成長が阻害され、Ca が存在します。ジェッテニアはCaと共存していた。亜硝酸塩が 160 mg NO2-NL-1 に増加するにつれて減少する前の B. caroliniensis。有機炭素の補給は、Ca と共進化する従属栄養群集の出現につながりました。 B.カロリニエンシス。 Ca. B.カロリニエンシスおよびCa. Jettenia は表面にバイオフィルムを優先的に形成しましたが、Ca. Brocadia sinica は懸濁液中で顆粒を形成しました。我々の結果は、複数のアナモックス細菌種が共存し、アナモックスリアクター内のサブニッチを占有しており、例えば窒素負荷を変えることによって優勢集団を可逆的にシフトさせることができることを示している（すなわち、高い亜硝酸塩濃度はCa. Brocadia caroliniensisに有利である）。種分化は廃水プロセス設計に影響を及ぼし、最適な細胞固定化戦略 (つまり担体と顆粒) はどの種が優勢であるかによって決まります。

部分硝化と組み合わせた嫌気性アンモニウム酸化（anammox）は、従来のプロセスと比べてエネルギーが大幅に節約されるため、窒素が豊富な廃水と炭素が不足している廃水の処理（側流処理など）に広く適用されています。また、都市廃水を処理するための持続可能な処理オプション (つまり、主流処理) としても提案されています。 19 種のカンジダトゥスアナモックス細菌種が、亜酸素海洋地帯、沿岸堆積物、湖、下水処理場などのさまざまな環境で確認されています。これらは 5 つのカンジダタス属 1、2、3 に分類されており、アナモックス細菌は多様な自然系および人工系に定着する可能性がありますが、異なる属が同じ生息地に共存することはほとんどありません 4。増殖速度、基質親和性、阻害性化合物に対する感受性、好ましい増殖基質、および異なる代謝経路の違いはすべて、ニッチの特殊化に寄与すると考えられています1、5、6、7、8、9、10。

種および属レベルでの個体数の変化は、さまざまな条件下のアナモックス実験室規模の反応器で報告されています9、10、11。最初の本格的な商用アナモックス反応器のスケールアップ中に、支配的な集団は Ca から移行しました。 Kunenia stuttgartiensis から Ca. Brocadia anammoxidans、ただしその理由は示されていない12。研究では、部分硝化/アナモックス (PN/A) 反応器内の特定の環境条件では、単一のアナモックス細菌種のみが選択されることが報告されています 11,13。たとえば、Ca. Jettenia moscovienalis2、Ca。 B. caroliniensis 14、および Ca. B. sinica13 は嫌気性消化液を処理する別個の側流反応器で検出されましたが、Ca. ブロカディア。 sp. 40 は、主流の条件下で優勢なアナモックス細菌として特定されました 15。 Park et al.11 は、アナモックス細菌の選択においては、接種材料やリアクターの構成よりも飼料組成の方が重要であることを示しました。それにもかかわらず、どの因子が別のアナモックス細菌種よりもあるアナモックス細菌種を選択するかについて明らかなコンセンサスはありません。

特定の動態学的特性および生理学的特性を持つ特定のアナモックス細菌種を濃縮する要因を解明すれば、プロセスの設計と性能が向上する可能性があります。アナモックス細菌は、アンモニウム/亜硝酸塩濃度がそれぞれ高いおよび低い側流および主流の PN/A システムなど、さまざまな条件に存在し、種の選択には多くの要因が関与している可能性があります。亜硝酸塩 (NO2-) は細菌にとって有毒ですが、アンモニウムの酸化では電子受容体として、また重炭酸塩をバイオマスに還元する場合は電子供与体としても機能します。したがって、アナモックス細菌の利用能力と耐性に基づいて、細菌種の選択圧力を加えます。 100 ～ 400 mg の NO2- 濃度に曝露されたアナモックス細菌では、アナモックス活性が 50% 低下することが報告されています (NL-116,17,18)。アナモックス生化学経路の中間体として亜硝酸塩から生成される強力な酸化剤である一酸化窒素（NO）は有毒ですが、アナモックス細菌は多くの細菌よりも高濃度に耐えることができます21、22。亜硝酸塩とNOからの潜在的な選択圧に加えて、有機基質（すなわち、酢酸塩とプロピオン酸塩）も消費する能力が、Caに競争上の利点を与えることがわかっています。 B.フルギダおよびCa. それぞれ、デニトリファーを含む他の種よりも、Anammoxoglobus propiononicus 6,7。このような「通性化学有機栄養生物」の選択が、主流の条件下に存在する複雑な有機炭素環境において有利に行われるかどうかはまだ判明していない。それにもかかわらず、アナモックス細菌は、アンモニウムと亜硝酸塩の濃度だけではなく、高度に特殊化されたニッチを占めています。

好ましい生理学的特性および増殖特性を備えた特定のアナモックス細菌種の活性を高める能力は、工業用アナモックスプロセスの開始および最適化に特に有利です。確立された側流のアナモックス汚泥は、新しい本格的な設備への播種またはバイオオーグメントに一般的に使用されますが、アナモックスリアクターを起動するために既存の本格的な非アナモックス設備から接種することは物流上困難であり 11、プロセスの敏感さのために時間がかかります。組成物、酸素12、競合する微生物種23を供給するため。アナモックス細菌の増殖速度が遅いため、アナモックスリアクターでは高いバイオマス保持率が必要です。これは、バイオフィルムベースのアナモックスリアクターでバイオマスの凝集を促進することによって達成できます24。アナモックス反応器内のバイオマスは、懸濁液中のフロック、表面または担体上の固定膜、小さな顆粒、大きな顆粒、またはこれらすべての形態の組み合わせに自己集合する可能性があります25。このような凝集体は反応器内で機能的に異なる役割を果たし、窒素除去効率にさえ影響を与える可能性があります 26,27。どの要因が種の選択を促進するのか、また、異なる種が特定のバイオフィルム形態を取るかどうかを理解することは、anammox バイオリアクターで通常遭遇する幅広い操作条件下でより安定した窒素除去を達成するためのプロセス設計と制御戦略に役立つ可能性があります 28。

この研究の目的は、アナモックス群集の構成、プロセスパフォーマンス、およびバイオフィルムの形態が、産業用アナモックスシステム（つまり、側流と比較した主流）で通常遭遇する要因によってどのように変化するかを調査することです。 (a) 家庭の主流および側流廃水 (反応器 R1) の N 負荷を伴う有機炭素欠乏廃水と、(b) への曝露により PN/A システムで通常遭遇する酸化ストレスをシミュレートする、異なる基質組成が仮定されました。 NO (反応器 R2)、または (c) 高 COD:N を含む家庭用主流廃水 (反応器 R3) は、明確なコミュニティ、特にアナモックス細菌種を選択する可能性があります。これらの要因の一部は以前に独立して調査されていますが 17,29 、この研究では同じ接種材料からのアナモックス細菌種の選択に関するこれらの要因を調査します。アナモックス種の相対的な存在量をどのように操作できるかについてさらなる洞察を得ることで、N 除去プロセスの設計に情報が得られ、複雑な微生物/環境生息地におけるニッチ分割の理解に貢献する可能性があります。

アナモックス細菌は、開始時間は異なりましたが、テストされたすべての濃縮条件下で成功裏に濃縮されました。開始期間はNOを補充したR2で最も短く、標準濃縮条件下で操作したR1では39日であったのに対し、アナモックス活性は接種後20日以内に観察された(図1A、B)。 R3 に複雑な有機炭素が存在する場合、アナモックス活性は 50 日間の操作後にのみ検出されました (図 1C)。 R1とR2の両方で、アンモニウムと亜硝酸塩の濃度はそれぞれ280 mg NL-1と350 mg NL-1に増加し（図1A、B）、それを超えるとアナモックス活性は阻害されました。始動期間が短いことに加えて、R2 では R1 よりも短い水圧保持時間 (HRT) が適用されました。これは、窒素除去率が 800 mg NL-1 day-1 と比較して 1200 mg NL-1 day-1 と高いためです。安定した動作を実現します (図 1A、B)。装填速度がより高いにもかかわらず、浮遊固体濃度は両方の反応器で同等であり、R1よりもR2の方が比窒素除去活性が高いことを示しています。 R3 では、121 ± 6 mg NL-1 day-1 という大幅に低い N 負荷率が達成されました。最終的な流出アンモニウム濃度は、58 日目から 80 日目にかけて着実に低下し、それ以降、リアクターはアナモックス細菌による安定したアンモニウム除去活性を示しました。排水中の残留亜硝酸塩も、アンモニウム濃度の減少に伴い、60 日目から 100 日目まで徐々に減少しました (図 1C)。排水中の平均総化学酸素要求量 (TCOD) と可溶性化学酸素要求量 (sCOD) は、それぞれ 87 ± 9 mg L-1 と 51 ± 8 mg L-1 で、平均除去率は 520 mg L-1 日でした。 300日目以降は-1。

(A) R1 でアンモニウムと亜硝酸塩を含む合成廃水、(B) R2 でアンモニウム、亜硝酸塩と一酸化窒素を継続的に供給する合成廃水、および (C) 一次処理を供給された活性汚泥からのアナモックス細菌の始動と濃縮R3 に亜硝酸塩を補充した排水。各濃縮条件の MLVSS ()、流入亜硝酸塩 (NO2、 )、および窒素負荷率 (NLR、 ) が各グラフの上部パネルに示されています。 Caに属する優勢なアナモックス細菌OTUが比較的豊富です。 B. caroliniensis () および Ca. B. sinica ()、および Anaerolineaceae () および Fimbriimonadia () に属する関連する非アナモックス細菌 OTU を (A、B) の下のパネルに示します。 Ca. R2(B)でもジェッテニア()が検出されました。 Ca. R3 における唯一の優勢なアナモックス細菌である B. caroliniensis を、コマモナダ科 () および Ca に属する相関する非アナモックス細菌 OTU とともに (C) に示します。 Aquirestis () が別の段階で優勢です。全アナモックス細菌の相対的な存在量は、各グラフの面積プロット () として強調表示されます。赤い点線は、アナモックスバイオフィルムが反応器の壁から掻き取られて懸濁液になった時点を示す。詳細な化学物質と微生物のコミュニティ (分析された時点で OTU が 5% を超える) は、補足図 S1、サポート情報にあります。

3 つのリアクターの微生物群集は、運転日 (R = 0.53、p = 0.007) および異なるリアクターの使用、つまり R1 対 R2 対 R3 (R = 0.38、p = 0.001) の使用によって区別されました。さらに、さまざまなレベルの N での R1 コミュニティと R2 コミュニティは比較的強い非類似性を示しました (それぞれ R = 0.48 と 0.57、両方とも p = 0.001)。アナモックス活性の増加に伴い、窒素負荷の増加に伴う機能的アナモックス細菌の変化がR1およびR2で観察されましたが、低窒素負荷が維持されたR3では観察されませんでした。 16S rRNA 遺伝子アンプリコンの配列決定により、3 つのリアクターすべてでリアクターの運転開始時にアナモックス細菌が検出限界未満 (< 0.018%) であることが示されました。 R1 および R2 では、流入亜硝酸塩濃度 > 200 mg N L で、アナモックス細菌に注釈が付けられた操作分類単位 (OTU) は、OTU の相対存在量のそれぞれ 80% (110 日目) および 90% (95 日目) まで徐々に増加しました。 1 (図1A、B)。異なるレベルの N レベルにおける R1 と R2 の微生物群集は、比較的強い非類似性を示しました (それぞれ R = 0.48 と 0.57、両方とも p = 0.001)。一方、高 N 負荷期間の微生物群集は高度に分化していませんでした (R = 0.29、p = 0.003)。 R1 と R2 の両方でアナモックス細菌に関連する複数の OTU の相対的な存在量が増加しているにもかかわらず、単一の OTU に Ca の注釈が付けられました。ブロカディア、Ca として識別されます。クローンライブラリー分析による B. caroliniensis (図 2)、原子炉運転の最初の 120 日間を通じて優勢であった。 Ca. B. caroliniensis は、濃縮中に R1 と R2 の相対存在量が 50% まで増加しました。しかし、100日目から流入アンモニウム濃度と亜硝酸塩濃度が220 mg NL-1を超えてさらに増加した(R1では500 mg NL-1-day-1、R2では750 mg NL-1-day-1のN負荷率)。 Caが徐々に増加します。 Brocadia_2、Ca として識別されます。クローンライブラリー分析による B. sinica (図 2)。

それぞれアンプリコン配列決定およびクローンライブラリー解析からの主要な OTU (接尾辞「*」) およびクローン (接尾辞「**」) の 16S rRNA 配列に基づく系統樹。採取した全コロニー当たりの同一コロニーの数を括弧内に示す。例えば、34/40は採取した40コロニー当たり34個の同一コロニーを示す。系統樹は SILVA データベースを使用した ARB によって生成されました。クローンライブラリーおよびアンプリコン配列決定から得られた配列を、ARBの節約挿入ツールを使用してツリーに挿入しました。最も近い隣接シーケンスが選択され、1000 回の複製のブートストラップによる隣接結合法で最終ツリーが生成されました。破線は Ca ファミリーの分割を示します。ブロカディア科 Ca 属。ブロカディア。 Methanosaeta concilii がアウトグループとして選択されました。最も近い同定された配列のみが選択されて表示されました。スケールは、ヌクレオチド位置ごとに 0.1 ヌクレオチドの変化を示します。主要なアナモックス細菌の配列の所属と相対存在量は、アンプリコン配列決定とクローンライブラリー分析の間で一致していました。

Caの減少。 B. caroliniensis も観察されました (図 1A、B)。原子炉の運転が 180 日を超えると、Ca. B. sinica は、R1 と R2 で相対存在量がそれぞれ 33% と 42% に増加しました。 B. caroliniensis は両方の反応器で相対的に存在量が 10% 未満に減少しました。有機炭素の存在下では、Ca. B. caroliniensis は、120 mg NL-1 day-1 の低 N 負荷率で操作された R3 での濃縮プロセス全体を通じて最も優勢なアナモックス分類群でした（図 1C）。しかし、アナモックス細菌全体の相対存在量は、R1 および R2 (約 80%) よりも R3 (約 50%) で著しく低く、有機炭素の存在下でアナモックス細菌にとってより競争力のある環境が示唆されました。 R1（80日目）およびR2（675日目）の蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）分析（図3D〜F）では、Caがさらに示されました。これらの反応器では B. sinica が優勢でしたが、Ca. B. caroliniensis は、R3 で検出された唯一のアナモックス細菌として残りました (683 日目)。設計された種特異的 FISH プローブは、制御因子の変化に応じて原子炉の運転中に徐々に個体数が変化する様子を観察するのに役立ちました。

R1 (A) および R2 (B) では粒状構造、R3 (C) では綿状構造を示す懸濁バイオマスサンプルの光学顕微鏡画像。 Ca の優位性を確認するために、粉砕された顆粒に対して実行された FISH 分析。 R1 (D) および R2 (E) の B. sinica (シアン) および Ca の普及率。フェーズ III 終了時の R3 (F) の B. caroliniensis (マゼンタ)。他のアナモックス細菌はすべて青色です。ここに示されている FISH 画像は文化を代表するものです。 (A)、(B)、(C) のスケールバーは 1 mm を示し、(D)、(E)、(F) は 1 μm を示します。

一方、他の OTU は Ca 属に属します。ブロカディアも検出されましたが、その相対存在量は 10% 未満でした (補足図 S1)。これらのCaの存在。 Brocadia OTU は、Ca の異なる株に起因すると考えられます。低い相対存在量のみが検出されたため、ブロカディアまたは配列エラー。 Ca以外にも。 Brocadia、Ca に所属する OTU。 Caと共存するために現れたジェッテニア。 B. caroliniensis は R2 のみに存在し (NO が継続的に供給されている)、NO の存在が Ca に競争上の利点をもたらす可能性があることを示唆しています。ジェッテニア。しかし、Ca. ジェッテニアは、窒素負荷率の増加とともに減少しました（すなわち、102日目以降）。

Ca. ジェッテニアは R2 でのみ観察され、R1 と R3 では観察されませんでした。これは NO の存在によるものと考えられます。しかし、濃縮プロセス中、NO の効果が酸化ストレスの印加によるものなのか、それともアンモニウム酸化の基質として使用されたためなのかは不明でした。濃縮中に亜硝酸塩が過剰だったため、これは評価できませんでした。したがって、NO が消費されるかどうかを調査するために、同量の NO (フェーズ I) を投与しながら、R2 (フェーズ II) で亜硝酸塩を体系的に枯渇させました。 76 日間亜硝酸塩を枯渇させた後、フェーズ III で亜硝酸塩を徐々に再導入しました (図 4)。

（A）Caに属するOTUのアナモックス細菌群集の変化に対する亜硝酸塩の枯渇（フェーズII）と補充（フェーズIII）の影響。 B. caroliniensis () および Ca. B.シニカ（）およびCa。懸濁状態のジェッテニア () (X 軸で「懸濁液中の顆粒」として強調表示) および付着した増殖バイオマス (X 軸で「壁上のバイオフィルム」として強調表示)、および R2 の NO 消費率 (NCR、 ) 、アンモニウム、亜硝酸塩を含む合成廃水と一酸化窒素の継続的な供給が供給されます。流入亜硝酸塩 (NO2) は、通常 (フェーズ I) から枯渇 (フェーズ II) および枯渇 (フェーズ III) まで調整されました。全アナモックス細菌の相対的な存在量は面積プロットとして強調表示されます ()。 FISH 画像は Ca を使用して撮影されました。シアンとCaのB.シニカ。破砕顆粒からのフェーズ I (B) およびフェーズ III (C) 中のマゼンタ色の B. caroliniensis。

亜硝酸塩濃度を下げると、Ca の相対存在量が減少しました。懸濁液中の B. sinica は NO 消費率 (NCR) の増加と同時に起こりましたが、両方の Ca についてわずかな増加が観察されました。 B.カロリニエンシスおよびCa. フェーズ II のジェッテニア (図 4)。 Caの存在。 B. caroliniensis はフェーズ I には存在しませんでしたが、フェーズ II の FISH 分析でも検出されました (図 4)。フェーズ II 中に実施されたバッチ活性テストでも、亜硝酸塩依存性アンモニウム除去率が、亜硝酸塩枯渇 (フェーズ I) 前の 1352 mg N g MLVSS-1 day-1 から、亜硝酸塩枯渇後 681 mg N g MLVSS-1 day-1 に低下したことが示されました。亜硝酸塩の枯渇（フェーズ II）。それにもかかわらず、R2 の全体的な活性は、575 mg N g MLVSS-1 day-1 の比亜硝酸塩依存性アンモニウム除去速度であっても、R1 よりも依然として高かった (図 5)。通常の運転 (フェーズ I) では、両方の反応器に亜硝酸塩が存在しない場合の NO 依存性アンモニウム酸化はわずかであり、NO ではなく亜硝酸塩が好ましい電子受容体であり、アンモニウム除去は Ca では達成できないという仮説をさらに裏付けています。 NO還元への直接結合を介したB.シニカ。対照的に、亜硝酸塩の非存在下での NO によるアンモニウム酸化速度は、フェーズ II での亜硝酸塩枯渇後の 440 mg N g MLVSS-1 日の R2 では、33 および 80 mg N g MLVSS-1 日と比較して 5 倍以上増加しました。通常動作時のフェーズ I では、R1 と R2 がそれぞれ -1 になります (図 5)。これは、外部から供給される NO を利用してアンモニウムを酸化できるアナモックス細菌種が選択されたことを示唆しています。

対照反応器 R1 および実験反応器 R2 での (i) NH4 + NO2、(ii) NH4 + NO2 + NO、(iii) NH4 + NO を使用したバッチ活性実験 (a) 亜硝酸塩制限前 (フェーズ I)、(b) 亜硝酸塩下制限（フェーズ II）および（c）亜硝酸塩補充後（フェーズ III）。

実験フェーズ III の開始時に、Ca. B. caroliniensis は Ca よりも相対的に豊富に存在することが判明しました。反応器の壁に形成されるバイオフィルム中の B. sinica (図 4)。 Ca. ジェッテニアも亜硝酸塩が存在しない場合、存在量は少ないものの（壁サンプルで観察）回復を示しました（図4）。これがフェーズ II での亜硝酸塩の枯渇の結果であるかどうかは確認できませんが、Ca の相対的な存在量は低くなります。 B.カロリニエンシスおよびCa. 壁から収集されたバイオフィルム内のジェッテニアは、通常の操作下よりも高かった（図 6 のフェーズ I）。 Caからの明らかな逆転。 B.カロリニエンシスからCa. 亜硝酸塩を再導入すると、650 日から 680 日の間に B. sinica が観察されました (図 4)。フェーズ II で検出されたものと同様に、Ca の相対存在量の増加。 B. sinica は、亜硝酸塩依存性アンモニウム酸化活性の 1163 mg N g MLVSS-1 day-1 の回復と同時に発生しました。これは、フェーズ I の活性 (1352 mg N g MLVSS-1 day-1) に匹敵します (図 4)。。さらに、NO 依存性アンモニウム酸化活性も 440 (フェーズ II) から 102 (フェーズ III) mg N g MLVSS-1 day-1 に減少しました (図 5)。これは、NO 消費量の増加がアンモニウム酸化活性と関連している可能性が高いことをさらに示唆しています。 Caの量が増加しました。 B.カロリニエンシスまたはCa. ジェッテニア、あるいはその両方。亜硝酸塩制限下での期間を延長すると、Ca の回収がさらに促進された可能性があります。ジェッテニアとCa。 B. caroliniensis が Ca. caroliniensis を上回る B.シニカ。それにもかかわらず、研究のこの部分は、亜硝酸塩とNO、種の選択、およびそれらの好ましい成長モードの間の関連性を裏付けています。

Ca に所属する主要な OTU の分布。 B.シニカおよびCa. B. caroliniensis と、ブロカディア科と注釈が付けられた他のアナモックス細菌および非アナモックス細菌（A）の壁（外層）および懸濁液（内核）中（A）289 日目の R1（B）、265 日目の R2（C）および 266 日目の R3 (D)。詳細な微生物群集の構成は、補足図S3のサポート情報にあります。

優勢なアナモックス細菌も、さまざまな濃縮条件下で付着増殖に対する明確な優先性を示しました。アナモックス細菌バイオマスは、R1およびR2では主に懸濁顆粒として存在しましたが、リアクター表面に付着したバイオフィルムがR3で優勢でした（補足図S2）。リアクターの壁から懸濁液へのバイオフィルムの移動後（図 1A ～ C の点線で示す）、R3 の MLVSS の大きな増加（230 日目で約 1.5 g L-1）が観察されました。他の 2 つのリアクター (R1 では 160、209、および 258 日目、R2 では 153、216、および 253 日目で 0.3 g L-1 未満) は、一次排水供給リアクター (R3、図 1) でのより付着したバイオフィルムの成長を示唆しています。 1C）。さらに、実験フェーズ III 中に亜硝酸塩を R2 に再導入した後、Ca. B. sinica は減少傾向を示し、懸濁液よりもリアクターの壁から収集されたバイオフィルムサンプル (図 4) でより顕著でした (p = 0.038)。壁サンプルと懸濁サンプル間の相対存在量の違いは、Ca の優先度を示しています。付着増殖用のB. caroliniensis。 Ca を含む R1 および R2 の壁および懸濁液から収集されたバイオマスサンプルのアナモックス細菌集団の間には有意差はありませんでした。優勢なアナモックス細菌としてのB. sinica。ただし、相対的に豊富なCaが優勢です。 B. caroliniensis は、R3 の懸濁液よりも壁から収集されたバイオマス中で 4 倍多く存在し (図 6)、この種が付着増殖する傾向があることをさらに示しています (図 6)。 R1 と R2 で顆粒が形成されることがわかりましたが (図 3A、B)、平均粒径はそれぞれ 1.52 および 1527.9 ± 0.078 μm (補足表 S2)、2 つのリアクター間では R = 0.35 (p = 0.006)、 R3 の凝集体の形態は他の 2 つのリアクターと比較してより綿状であり (図 3C)、粒子サイズは 310.4 ± 0.2 μm (補足表 S2)、R = 0.67 (p = 0.001) でした。したがって、Ca. 有機炭素を含む家庭廃水条件下で濃縮された B. caroliniensis は、Ca とは対照的に、顆粒の成熟をサポートできず、代わりに壁にバイオフィルムを形成します。 B. sinica は主に粒状バイオマスで検出されました。

また、さまざまな濃縮戦略により、3 つのリアクターすべてで個別の非アナモックス細菌コミュニティが形成され、R1 および R2 と比較して R3 では非アナモックス細菌 OTU の存在量が高くなりました (図 S1G、H および I)。炭素源の補充により、R3 の微生物群集 (Chao1: 614 ± 42) の富化 (補足表 S1) が増加しましたが、アナモックス細菌 (シンプソン) ではなく非アナモックス細菌群集 (シンプソン 1-D: 0.04 ± 0.01) が選択的に富化されました。 1-D: 0.75 ± 0.17)。亜硝酸塩およびアンモニウムを R1 および R2 の主基質として使用した場合、濃度の低下が観察されました (Chao1: それぞれ 233 ± 31 および 249 ± 32)。 NO を補充すると、R1 よりも R2 の方がリッチさがわずかに高くなりますが、均一性は低くなります。 Ca. B. sinica は、R1 において未分類の線毛綱（アルマチモナデ門）および未分類のアナエロリン科（クロロフレキシ門）に属する OTU と正の相関を示しました（スピアマンの rho > 0.8、p < 0.001）。非アナモックス細菌の相対的な存在量は NO の存在下で減少しましたが、それでも同じ相関関係が R2 で観察されました。しかし、R3 では、非アナモックス細菌群集が未分類のコマモナダ科 (プロテオバクテリア門) および未分類のバクテロイデス属に属する OTU に置き換えられ、未分類のバクテロイデス属と Ca の間に負の相関が観察されました。 B. caroliniensis (スピアマンのρ: − 0.7、p < 0.001)。注目すべきことに、コマモナダ科に属する分類群はR1およびR2にはほとんど存在しなかったが、R3では反応器壁に付着したバイオマスおよび浮遊状態のバイオマスの両方において優勢な従属栄養群集のままであり、おそらくこれらの分類群がCaと代謝相互作用を持っていることを示唆している。 B. caroliniensis であり、バイオフィルムの形成に役割を果たします（補足図S3）。

望ましい生理学的特性および増殖特性を備えた集団を選択するには、アナモックス細菌のニッチ分化を促進する因子を記述する必要があります。これにより、プロセス制御と動作の安定性が向上します。 Caに関連するアナモックス細菌OTU。カリフォルニア州ブロカディアカリフォルニア州クエニアアナンモクソグロブス、Ca. Jettenia OTU はすべて廃水処理システムで検出されています3。ここで、アナモックス細菌集団は、同じ活性汚泥接種材料から選択されました。これは、主流および側流 PN/A システムに関連するさまざまな濃度と負荷でさまざまな基質 (つまり、アンモニウム、亜硝酸塩、有機炭素、NO) を提供することによって達成されました。 2 つの重要なアナモックス細菌種、Ca の再現可能な濃縮。 B.カロリニエンシスおよびCa. B. sinica は、熱帯地方の単一種子活性汚泥から得られ、それらの好ましい生態的ニッチが記載されています。 Ca. B. caroliniensis は、N 負荷が 500 mg NL-1 day-1 未満、およびそれより低い N 濃度（流入アンモニウムおよび亜硝酸塩濃度がそれぞれ 200 および 250 未満）では、すべての反応器で優勢でした。 N 負荷と濃度の増加により、Ca への移行が起こりました。 B.シニカ。 Ca. B. caroliniensis は、低 N 負荷条件下での R3 での蔓延によって示されるように、有機炭素の存在下でも最も競争力のある種でした。

Ca.の可能性があります。 B.カロリニエンシスおよびCa. B. sinica は、N 負荷を上げるために亜硝酸塩濃度が増加したため、亜硝酸塩阻害に対する感受性の違いにより独自のニッチを発達させました。 Caからの人口の移動。 B.カロリニエンシスからCa. B. sinica は、供給物中の NO2-NL-1 が 340 mg (つまり、反応器中の NO2-NL-1 が 170 mg) を超える亜硝酸塩濃度の増加とともに一貫して観察されました。これは、アナモックス細菌について報告されている 40 ～ 400 mg NL-116、17、18、30、31、32 の阻害濃度の範囲内ですが、このような変化は種レベルでこれまで調査されていませんでした。

この変化の別の説明は、Ca である可能性があります。 B.カロリニエンシスおよびCa. B. sinica は異なる固有の速度論的特性を持っています。濃縮浮遊細胞を使用して、亜硝酸塩親和定数と Ca の比増殖速度を測定します。 B. sinica は 0.47 mg NL-1 および 0.33 day-1 (倍加時間 2.1 日に相当) 29,33 と測定され、これはアナモックス細菌としてこれまでに報告された最高の最大増殖速度です。これは、Ca. 私たちの研究で観察されたように、B. sinica は r 戦略家であり、高い N 負荷率とアンモニウムおよび亜硝酸塩の濃度で増殖します 33。ただし、Ca についても同様の推定が行われます。 B. caroliniensis がありません。メタゲノム分析により、Ca. B. caroliniensis は、固有の亜硝酸塩親和定数が低いため、低亜硝酸塩濃度で競争上の優位性を提供する亜硝酸塩/ギ酸塩トランスポーター (focA) のコピーを複数持っています 14。これは、特に有機炭素の存在下で亜硝酸塩の競合がより激しい場合に、従属栄養性脱窒剤から亜硝酸塩を捕捉するのに役立つ可能性があります。

3 つの濃縮反応器全体に広範囲の環境条件が適用されたにもかかわらず、Ca. Brocadia は濃縮プロセスを通じて最も優勢な系統型であり続けましたが、Ca. クエニアとCa. 人工システムで一般的に見られるアナモクソグロバスは検出されませんでした。接種材料中のすべてのアナモックス細菌の存在量は低かったが、操作条件、特に比較的高い窒素負荷が Ca の濃縮に寄与した。他よりもブロカディア34。

NO は、酸化ストレスを発揮するため、また NO を利用するアナモックス細菌を潜在的に選択するために R2 に提供されました 35。 NO の存在はアナモックス細菌の増殖を抑制するようには見えませんが、Ca に競争上の利点をもたらした可能性があります。 R2 のジェッテニアは、Ca とともに最大相対存在量 23% まで増加しました。低窒素負荷時の B. caroliniensis (図 1)。 Caのニッチの生態学的および代謝的要因についてはほとんど知られていない。ジェッテニア。おそらく、他の属のアナモックスバクテリアよりも一般的に量が少ないためです 3。亜硝酸塩濃度が低いと、Ca の増殖が促進されることが示されました。 Caの上のジェッテニア。 B. sinica4、この研究と一致。しかし、Ca. ジェッテニアは Ca よりもはるかに少ない量でした。亜硝酸塩負荷率が低い場合の B. caroliniensis。それにもかかわらず、系統発生的に遠い２つのアナモックス細菌種、Ｃａ． B.カロリニエンシスおよびCa. Jettenia は同じシステム内に共存することが示されており、これは以前の発見を裏付けています 3。ただし、微生物群集のモニタリングは 16S rRNA 遺伝子のみに基づいているため、遺伝子の単一領域に焦点を当てると偏りが生じる可能性があります。定量化の精度を向上させるために、複数のプライマー配列決定アプローチを使用したさらなる検証を行うことができます 36。

Caの共進化。 B.カロリニエンシスおよびCa. ジェッテニアも Ca を示唆するかもしれません。 B. caroliniensis は NO を利用する可能性があります。 Caにおける同様の亜硝酸塩還元経路。 B.カロリニエンシスおよびCa. Ca のメタゲノム解析から nirK 相同体が検出された後、ジェッテニアが示唆されました。 B. カロリンエンシス14,37。亜硝酸塩制限後の NO 依存性アンモニウム酸化の顕著な増加は、Ca の回復と同時に起こりました。 B.カロリニエンシスおよびCa. ジェッテニアの個体群。最近の研究では、Ca での nirS の発見が報告されました。ただし、Brocadia ゲノム 38 では弱い転写物しか見つからず、この観察には追加の検証が必要です。 Ca.であることが考えられます。 B. caroliniensis は、nirK ホモログまたは新規亜硝酸還元酵素を利用し、ヒドラジン生成に従来の NO 依存性経路を使用するか、亜硝酸塩の非存在下で NO 依存性経路に切り替える能力を持っています。ヒドロキシルアミン酸化還元酵素 (hao) 様タンパク質によるヒドロキシルアミンの酸化による NO 生成の代替経路は、実際に Park ら 14 と Irisa ら 39 によって検出されました。彼らは、この代替経路が亜硝酸塩制限下で活性化される可能性があると提案しました 14。 NO は、Ca の亜硝酸塩制限下でアンモニウムを二窒素ガスに酸化することも示されました。 B. fulgida21 および標準的な nirS はそのゲノムに存在しませんでした 40。

対照的に、NO 依存性のアンモニウム酸化は、著しく高い NO 濃度では無視できる程度であり、NO ではなく亜硝酸塩が好ましい電子受容体であり、アンモニウム除去は Ca では達成できないという主張をさらに裏付けています。 B. sinica による NO 還元への直接結合 (図 5)。一方、Ca。 B. sinica は亜硝酸塩の非存在下では完全に阻害されず、前述したように亜硝酸塩の制限下ではその相対存在量が減少しました。これは、Ca が 2 であることを実証する Oseki et al.41 の研究を裏付けています。 B. sinica はヒドラジン合成に NO とアンモニウムを利用せず、代わりにヒドロキシルアミンとアンモニウムを使用します。 Shawら42は、15N標識実験を用いて、Ca中のNOの代わりに中間体としてヒドロキシルアミンを介してアンモニウムが二窒素に酸化されることを明らかにした。電子受容体として電極を用いたブロカディア濃縮培養。ただし、純粋培養が存在しない場合、絶対的な自信を持って行動を種に割り当てることは不可能であることに注意してください。すべてのアナモックス細菌は培養不可能であり、行動を種に帰し、そのニッチと最適な増殖条件を特定する唯一の選択肢は、濃縮反応器に関する現象学的研究です。ここでは、50 ～ 80% の濃縮が達成されましたが、これは人口濃縮炉としては高水準です 43。これらは、これまで SBR で達成されたアナモックス濃縮度の中で最も高いものにランクされます 44。 Percoll 密度遠心分離により 99.5% まで濃縮できます 45 が、必要なバイオマスが多いため、種レベルでの微生物群集の分解が妨げられます。一方、膜バイオリアクターはプランクトンの Ca 集団を濃縮するために使用されています。 B. シニカ、Ca。 Scalindua29 と Ca. K. stuttgartsiensis10、私たちのアプローチは、B. caroliniensis や Ca などのバイオフィルムでの生育を好む種にも強化されています。ジェッテニア。

アナモックス細菌の増殖速度は遅いため、リアクター内でのアナモックス細菌の高い保持率は最適な運転にとって重要な要素です。これは、担体へのバイオフィルムの付着、粒状バイオマス凝集体の形成、およびアナモックス細菌の洗い流しを防ぐための膜濾過などの他の分離技術によって達成できます。アナモックスシステムにおけるバイオマス保持の選択は、特定の操作条件下で優勢なアナモックス細菌種の増殖モードおよび共存する微生物群集によって決まる可能性があります。この研究では、アナモックス細菌群集とその凝集状態が主流条件と側流条件下では異なる可能性があることが実証されました。 Ca. B. caroliniensis は、おそらく主流の条件下で存続し、付着したバイオフィルムの成長を好む傾向を示しました。 R3 の高い多様性と豊富な従属栄養種は、複雑な有機炭素の存在下でも観察されました。特に、コマモナダ科は、懸濁液およびバイオフィルムの両方において、システム内で最も豊富な従属栄養生物の 1 つであり続けています。コモモナダ科はバイオフィルム形成群集で一般的に見られ 46,47 、バイオフィルム形成を助ける潜在的な役割を示唆しています。 Caの付着成長。 B. caroliniensis は、外部炭素源としてグリセロールが供給される嫌気性消化槽液を処理する本格的なプロセスでも観察されました 14。この場合、担体を使用して大きな表面積を提供し、高いバイオマス保持率を達成できます48。付着したバイオフィルムの成長をサポートするキャリアは、回転生物学的接触器 49、移動床バイオフィルムリアクター 50、51、およびシーケンスバッチバイオフィルムリアクター 52 など、さまざまな構成で適用できます。しかし、Ca. B. シニカが優勢なアナモックスバイオフィルムは顆粒を形成しており（側流条件下で運転される R1 および R2 で観察されたとおり）、DEMON SBR システム 53 のような液体サイクロン、ラメラ分離器 54、または一体型固定膜活性汚泥 (IFAS) 構成を使用して物理的に分離できます。入植者55。特定の細胞外タンパク質が、Ca の細胞外マトリックスに非常に豊富に存在することが判明しました。 B. シニカ顆粒。相分離（液滴とゲル）し、接着を促進する能力により、いくつかの長さスケールにわたってバイオフィルムの形成を促進します56。これは、Ca の傾向がより大きいことを説明できるかもしれません。 B. sinica は自己凝集します (つまり、Ca. B caroliensis や Ca. Jettenia とは異なり、基質がない場合)。外部から供給される有機炭素が存在しないにもかかわらず、Fimbriimonadia 綱 (Armatimonadetes 門) および Anaerolineaceae 科 (Chloroflexi 門) に属する従属栄養生物は、R1 および R2 で 10 ～ 15% の相対存在量まで増殖しました。 Gao et al.57 は、アナモックス汚泥における顆粒形成のコアまたは担体としてのアナエロリン科の重要な役割と、時間の経過とともに存在量が増加することは、それらが R1 と R2 の両方で顆粒化を支援した可能性があることを示唆していると示唆しました。ただし、従属栄養細菌の役割とアナモックス細菌との相互作用は、この研究では完全には解明されていないため、さらなる調査が必要です。

複数のアナモックス細菌種を同じ活性汚泥から濃縮できます。 Ca. B. caroliniensis は、有機炭素の存在下および非存在下、および亜硝酸塩制限下での低 N 負荷で優勢であり、付着したバイオフィルムを形成します。 Ca. B. シニカは、より高い N 負荷でそれを上回り、顆粒を形成します。また、NO の補給は、硝酸塩濃度が高くなると Ca ジェッテニアが依然として消失するにもかかわらず、Ca ジェッテニアを促進します。したがって、Ca. B. caroliensis は主流の廃水アナモックスプロセスで優勢である可能性が高く、そこではキャリアが最良のバイオフィルム滞留戦略となり、顆粒を用いた側流処理における Ca B. sinica が最良の滞留戦略となり、Ca Jettenia は廃水処理システムで競合する可能性は低い。総合すると、この研究は、主流および側流の用途における種の選択、成長形態、およびプロセス条件の関係を理解するための洞察を提供し、本格的な廃水処理システムにおける種レベルでのアナモックスプロセスのプロセス設計、制御および管理に重要な意味を持ちます。

ここでは、それぞれ作業容積 4 L (内径 140 mm、高さ 260 mm) の 3 台のパースペックスシーケンスバッチリアクター (SBR) を使用し、上部に取り付けられたインペラ (半径 30 mm) で 200 rpm で撹拌しました。これらには、シンガポールで生物学的栄養素の除去と生活用水と工業用水の処理を行う本格的な水再生プラント（WRP）からの活性汚泥が播種されました。 R1 と R2 には有機炭素を含まない合成培地が与えられましたが、R3 には複雑な有機炭素源を含む WRP から収集された一次廃液が週に 1 回与えられました。合成培地は、(g L-1): KHCO3 1.25、KH2PO4 0.025、CaCl2・6H2O 0.3、MgSO4・7H2O 0.2、および FeSO4・7H2O 0.025 として調製し、アンモニウム (30 から 280 mg NL-1) および亜硝酸塩濃度を徐々に増加させました。 van de Graaf et al.58 に記載されているように、(39 ～ 350 mg NL-1) および 1.25 mL L-1 の微量ミネラル溶液。アルゴン/CO2 (95/5%) は無酸素相全体を通じて 25 mL min-1 で連続的にスパージされ、R1 への酸素の侵入を防止しました。一方、R2 にはアルゴン/CO2 と NO の両方が合計 25 mL min-1 のスパージング速度でスパージされました。１から４００ｐｐｍｖの最終ＮＯ気相濃度まで酸化ストレスを与える。選択された濃度 400 ppmv は、以前に報告されたアナモックス細菌の許容閾値 600 ppmv よりも低かった 22。 R1 と R2 は 12 時間のサイクルで操作され、各サイクルは 5 分間の供給、108 分間の無酸素サイクル、67 分間の沈降およびデカントから構成されていました。最初の 7 週間、反応器内のアンモニウムと亜硝酸塩の初期濃度は 20 mg NL-1 に維持され、水力滞留時間 (HRT) は 24 時間となりました (各サイクルで 2 リットルの合成廃水が反応器に供給されました)。 100% アンモニウム除去が達成されたら、飼料中の NH4+ および NO2- 濃度を 20 mg NL-1 ずつ増加させました。流入液 NO2-:NH4+ は、理論上の化学量論に近い 1.3 のモル比に維持されました 59。 HRT は、N 除去能力に応じて、R1 では 24 時間から 16 時間まで、R2 では 24 時間から 12 時間まで徐々に減少しました。したがって、R2 では、R2 での高い N 除去速度に伴うサイクル時間の短縮により、R2 は R1 と比較して高い N 装填速度で運転されました。 pHはR1でもR2でも制御されず、7.2～7.8の間で変動した。

R3 は 8 ～ 12 時間のサイクルで操作され、各サイクルは 2 時間の供給、5 ～ 9 時間の無酸素段階 (適用されるサイクルの長さに応じて)、および 1 時間の沈降とデカントで構成されていました。沈降する前に、反応器にアルゴン/CO2 を 5 分間散布して、無酸素相中に生成される窒素ガスを除去し、スラッジの沈降能力を向上させました。各給餌期間に、亜硝酸塩を補充した一次排水 2 L を追加し、HRT は 16 ～ 24 時間となりました。亜硝酸塩はアンモニウム濃度に応じてモル比 2:1 に調整され、分解を最小限に抑えるために 4 °C の冷却器に保管されました。一次排水の栄養組成は、亜硝酸塩の添加後に測定され、平均値は補足表S1に示されています。冷却装置に保管されている一次流出液からの酸素の導入と温度ショックを最小限に抑えるために、2 時間のゆっくりとした供給が適用されました。反応器のｐＨは制御されず、脱窒活性のため７．６と８．５の間で変動した。濃縮を目的として、3 基すべての反応器で SRT は制御されず、汚泥の損失は栄養素および固形分分析のためのサンプリングを通じてのみ発生しました (SRT は 20 日を超えると推定されました)。

加熱ジャケットを接続して、SBR を R1 および R2 では 35 ± 0.05 °C、R3 では 33 ± 1 °C に維持しました。溶存酸素 (DO) 濃度と pH は、それぞれ Mettler Toledo InPro6050 DO センサーと Mettler Toledo-InPro 3250i pH センサーを使用して継続的に監視されました。サンプルはサイクルの終わりに定期的に収集され、栄養素分析のために 0.2 µm フィルターですぐに濾過されました。混合液サンプルは、DNA 抽出のために無酸素相の中央で収集されました。リアクター表面のバイオフィルムの微生物組成を決定するために、R1 では 289 日目、R2 では 265 日目、R3 では 266 日目にリアクターを排水した後、壁からのバイオマスサンプルを 3 つのランダムな場所から収集しました。収集した懸濁サンプルとバイオフィルムサンプルは両方とも液体窒素中で急速冷凍し、抽出まで -80 °C で保存しました。反応器表面のバイオフィルムを定期的に洗浄して、総混合液懸濁物質 (MLSS) および揮発性画分 (MLVSS) の濃度、および懸濁液中のバイオマスと付着した増殖物の割合を測定しました。懸濁バイオマスサンプルも粒子サイズ分析のために収集され、安定した濃縮後の光学顕微鏡イメージングが達成されました。

アナモックス細菌種の選択に対する選択圧としての NO の効果をさらに検証するために、安定した動作が達成された後の 3 つの実験フェーズにわたって、電子受容体としての NO の利用可能性を維持しながら、R2 を段階的な亜硝酸塩の枯渇と補充にさらしました。フェーズ I - 通常の動作亜硝酸塩が枯渇する前は、気相中に 400 ppmv の NO が継続的に供給されていたため、飼料中のアンモニウムと亜硝酸塩の濃度はそれぞれ 280 と 350 mg NL-1 でした (563 日目以前)。フェーズ II - 亜硝酸塩制限操作 (564 ～ 640 日)。アンモニウムと NO はそれぞれ 50 mg NH4-NL-1 と 400 ppmv に維持しながら、亜硝酸塩を 50 mg から 0 mg NO2-NL-1 に段階的に減少させました。フェーズ III (640 ～ 687 日) では、フェーズ II で前述したアンモニウムおよび NO 濃度で、亜硝酸塩を 0 ～ 70 mg の NO2-NL-1 に徐々に再導入しました。懸濁バイオマスサンプルは、実験全体を通して混合液から週に2回収集されましたが、壁バイオマスの量が限られていたため、壁に付着したバイオフィルムはフェーズIIIでのみ収集されました。各実験段階では、(i) アンモニウムと亜硝酸塩のみを使用した以下の条件下で、気相中の 80 mg NH4+-NL-1、100 mg NO2-NL-1 および/または 400 ppmv NO を使用してバッチ活性試験を 3 回実施しました。 (ii) アンモニウム、亜硝酸塩および NO 、および (iii) アンモニウムと NO のみの存在。基質としてアンモニウムと亜硝酸塩を供給した通常の操作下での R1 のアナモックス活性を対照として使用しました。すべてのバッチ活性テストにおいて、混合液サンプルは 30 分ごとに収集され、栄養素分析のために 0.22 μm ミリポアフィルターでろ過されました。

栄養素分析のために収集されたすべてのサンプルは、アンモニウム、亜硝酸塩、硝酸塩について測定されました。アンモニウムはHach®キットを使用して測定し、硝酸塩および亜硝酸塩はイオンクロマトグラフィー(Prominence、島津製作所)を使用して分析しました。 MLSS および MLVSS は標準的な方法 60 に従って分析されました。オンライン化学発光分析装置 (モデル: 42i、Thermoscientific) を使用して、気相中の NO を測定しました。粒度分析はレーザー回折粒度分析装置（モデル：SALD-MS30、島津製作所）を使用して実行され、異なる反応器から収集されたサンプルの粒度測定に対してANOSIM分析が実行されました。

懸濁バイオマスを各反応器から収集し、サイズ分析に供した。 1 mL のバイオマスをペトリ皿の表面に分散させ、ブリック/シール機能を備えた AxioObserver Z1 倒立落射蛍光顕微鏡 (Leica、ドイツ) で画像を撮影しました。次に、画像 J61 粒子分析機能を使用して画像を分析しました。

Albertsen et al. に従って最適化した FastDNA™ SPIN Kit for Soil (MP Biomedicals, USA) を使用して、バイオマスサンプルからゲノム DNA を抽出しました。（2015年）。ペアエンド 16S rRNA 遺伝子アンプリコンの配列決定は、オールボー大学 (デンマーク) の DNAsense (http://dnasense.com/) により、プライマーセット 515F (5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3') および 806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-) を使用して実施されました。 3') (Caporaso et al. 2011)、Law et al. に記載されている Illumina Miseq プラットフォームによる。（2016年）。詳細なデータ分析については、サポート情報 (SI) を参照してください。

種レベルの分類の同定をさらに確認するために、R1 から 74,280 日目と R2 から 85,270 日目に収集したサンプルから 4 つの 16S rRNA 遺伝子クローンライブラリを構築しました。クローンライブラリーおよび16S rRNAアンプリコン配列決定から得られた配列を使用して、ARBによって系統樹を作成しました。クローンライブラリーおよび系統樹構築の方法は、SI に詳細に記載されています。

懸濁バイオマスサンプルを収集し、4% パラホルムアルデヒド (PFA) で一晩固定しました。 1 × リン酸緩衝生理食塩水 (PBS、130 mM 塩化ナトリウム、10 mM リン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.2) で洗浄した後、バイオマスサンプルを 1:1 100% エタノール:1 × PBS とともに -20 °C で保存しました。 Daims et al.62 が記載した方法に従い、表 1 に記載のプローブを使用して破砕バイオマスサンプルに対して FISH を実施しました。スライドは Zeiss LSM 780 倒立共焦点顕微鏡 (Carl Zeiss、イエナ、ドイツ) を使用して観察しました。

この原稿で使用されているすべての生の 16S rRNA アンプリコンシーケンスは、Bioproject PRJNA604076 の下で NCBI で入手できます。この研究のデータをリクエストするには、責任著者の Thomas Seviour ([email protected]) に連絡してください。

アリ、M.ら。嫌気性アンモニア酸化細菌 Candidatus、「Jettenia caeni」の生理学的特徴付け。環境。微生物。 17、2172–2189 (2015)。

記事 CAS Google Scholar

ニコラエフ、YAら。 Candidatus "Jettenia moscovienalis" sp. 11 月、嫌気性アンモニウム酸化を行う新種の細菌。微生物学 84、256–262 (2015)。

記事 CAS Google Scholar

Sonthiphand, P.、Hall, MW & Neufeld, JD 嫌気性アンモニア酸化 (anammox) 細菌の生物地理学。フロント。微生物。 5、399 (2014)。

記事 Google Scholar

Zhang、L.ら。亜硝酸塩制限バイオリアクターにおけるアナモックス細菌間の微生物競合。水耐性 125、249–258 (2017)。

記事 CAS Google Scholar

ディン、Ｓ．ら。嫌気性アンモニア酸化細菌の生態的特徴。応用微生物。バイオテクノロジー。 97、1841–1849 (2013)。

記事 CAS Google Scholar

Kartal、B. et al. Candidatus "Anammoxoglobus propioncus" は、嫌気性アンモニア酸化細菌の新しいプロピオン酸酸化種です。システム。応用微生物。 30、39–49 (2007)。

記事 CAS Google Scholar

Kartal、B. et al. 候補「Brocadia fulgida」：自家蛍光性の嫌気性アンモニア酸化細菌。 FEMS 微生物。 63、46–55 (2008)。

記事 CAS Google Scholar

大敷正人、下川正人、藤井直人、佐藤英生、岡部晋也、嫌気性アンモニア酸化細菌 Candidatus "Brocadia sinica" の生理学的特徴。微生物学 157、1706–1713 (2011)。

記事 CAS Google Scholar

Park, H.、Sundar, S.、Ma, Y. & Chandran, K. 亜硝酸化 - アナモックスプロセスにおける浮遊細菌および付着細菌の微生物生態および活動の分化。バイオテクノロジー。バイオエンジ。 112、272–279 (2015)。

記事 CAS Google Scholar

ファン・デル・スター、WR 他メンブレンバイオリアクター: アナモックス細菌を遊離細胞として増殖させる新しいツール。バイオテクノロジー。バイオエンジ。 101、286–294 (2008)。

記事 Google Scholar

Park, H. et al. 嫌気性アンモニア酸化（anammox）バイオリアクターコミュニティの分子微生物生態学に対する接種材料と増殖モードの影響。水耐性 44、5005–5013 (2010)。

記事 CAS Google Scholar

デア・スター、WRVら。無酸素アンモニウム酸化用の反応器の起動: ロッテルダムにある最初の本格的なアナモックス反応器の経験。水耐性 41、4149–4163 (2007)。

記事 Google Scholar

Hu、B.ら。 8 つの窒素除去リアクターにおけるアナモックス細菌の同定と定量化。水耐性 44、5014–5020 (2010)。

記事 CAS Google Scholar

Park, H.、Brotto, AC、van Loosdrecht, MC & Chandran, K. 本格的なグリセロール供給亜硝酸化・脱硝分離分離濃縮物処理プロセスにおけるカンジダトゥス「ブロカディア・カロリニエンシス」に関連するアナモックス細菌濃縮の発見とメタゲノム解析。水耐性 111、265–273 (2017)。

記事 CAS Google Scholar

Cao、Y.ら。シンガポールにおける 200,000 m3/日の活性汚泥プロセスにおける部分硝化とアナモックスの主流: 実験室流加反応器を使用することによるスケールダウン。水科学テクノロジー。 74、48–56 (2016)。

記事 Google Scholar

木村裕子、井坂和人、風間文夫、隅野哲史、嫌気性アンモニウム酸化に対する亜硝酸塩阻害の効果。応用微生物。バイオテクノロジー。 86、359–365 (2010)。

記事 CAS Google Scholar

Lotti, T.、der Star, WV、Kleerebezem, R.、Lubello, C. & Loosdrecht, MV アナモックスプロセスに対する亜硝酸塩阻害の効果。水耐性 46、2559–2569 (2012)。

記事 CAS Google Scholar

Strous, M.、Kuenen, JG & Jetten, MS 嫌気性アンモニウム酸化の重要な生理学。アプリ。環境。微生物。 65、3248–3250 (1999)。

記事 ADS CAS Google Scholar

Kartal、B. et al. 嫌気性アンモニウム酸化の分子機構。 Nature 479、127–130 (2011)。

記事 ADS CAS Google Scholar

ストラウス、M. et al. アナモックス細菌の進化と代謝を群集ゲノムから解読する。 Nature 440、790–794 (2006)。

記事 ADS Google Scholar

Kartal、B. et al. アナモックス細菌に対する一酸化窒素の影響。応用環境。微生物。 76、6304–6306 (2010)。

記事 ADS CAS Google Scholar

シュミット、I.ら。窒素酸化物 (NOx) の存在下での 2 つの異なる岩石栄養体による嫌気性アンモニア酸化。応用環境。微生物。 68、5351–5357 (2002)。

記事 ADS CAS Google Scholar

Lackner, S.、Terada, A. & Smets, BF 従属栄養活性は、膜通気バイオフィルムにおける独立栄養性窒素除去を損なう：モデリング研究の結果。水耐性 42、1102–1112 (2008)。

記事 CAS Google Scholar

Strous, M.、Heijnen, J.、Kuenen, J. & Jetten, M. ゆっくりと増殖する嫌気性アンモニウム酸化微生物の研究のための強力なツールとしてのシーケンスバッチリアクター。応用微生物。バイオテクノロジー。 50、589–596 (1998)。

記事 CAS Google Scholar

Hubaux, N.、Wells, G. & Morgenroth, E. 硝化処理とアナモックスを組み合わせた粒状汚泥反応器の性能に対するフロックとバイオフィルムの共存の影響。水耐性 68、127–139 (2015)。

記事 CAS Google Scholar

Vlaeminck, SE et al. 凝集体のサイズと構造により、一段階の部分硝化とアナモックスの微生物の活動バランスが決まります。応用環境。微生物。 76、900–909 (2010)。

記事 ADS CAS Google Scholar

Volcke, E.、Picioreanu, C.、Baets, BD & Loosdrecht, MV アナモックスベースの粒状汚泥反応器内の顆粒サイズ分布は変換に影響を与えます - モデル化への影響。バイオテクノロジー。バイオエンジ。 109、1629–1636 (2012)。

記事 CAS Google Scholar

Wang, Q. & He, J. アナモックスと脱窒細菌の提携は、アナモックスの飢餓からの回復と完全な窒素除去に利益をもたらします。科学。トータル環境。 815、152696 (2022)。

記事 ADS CAS Google Scholar

大敷正人、粟田哲也、金田一哲、佐藤宏、岡部真司、メンブレンバイオリアクターを用いた浮遊性嫌気性アンモニア酸化（アナモックス）細菌の培養。微生物環境。 28、436–443 (2013)。

記事 Google Scholar

Bettazzi, E.、Caffaz, S.、Vannini, C. & Lubello, C. アナモックス細菌に対する亜硝酸塩阻害と中間体の影響: バッチ規模の実験研究。プロセス生化学。 45、573–580 (2010)。

記事 CAS Google Scholar

Dapena-Mora、A. et al. 窒素ガス生成に基づくバッチ試験によるアナモックスプロセスに対する活性と阻害効果の評価。酵素微生物。テクノロジー。 40、859–865 (2007)。

記事 CAS Google Scholar

Fux, C.、Marchesi, V.、Brunner, I. & Siegrist, H. 固定床反応器におけるアンモニウムに富んだ廃棄物流の嫌気性アンモニウム酸化。水科学テクノロジー。 49、77–82 (2004)。

記事 CAS Google Scholar

Zhang、L.ら。アナモックス細菌の最大比増殖速度を再検討します。水耐性 116、296–303 (2017)。

記事 CAS Google Scholar

コスタ、MCMSら。 2 つのアナモックスリアクターの微生物群集構造に対する接種材料と操作条件の影響。環境。テクノロジー。 35、1811–1822 (2014)。

記事 CAS Google Scholar

Hu、Z.、Wessels、HJCT、van Alen、T.、Jetten、MSM & Kartal、B. 一酸化窒素依存性の嫌気性アンモニウム酸化。ナット。共通。 10、1244 (2019)。

記事 ADS Google Scholar

Orschler, L.、Agrawal, S. & Lackner, S. 部分硝化アナモックス反応器の微生物群集分析における曖昧さの解決について。科学。英国下院議員。 9, 6954 (2019)。

記事 ADS Google Scholar

Hu, Z.、Speth, DR、Francoijs, K.-J.、Quan, Z.-X.、Jetten, M. 複雑な群集のメタゲノム解析により、アナモックス細菌 Candidatus "Jettenia asiatica" の代謝青写真が明らかになりました。フロント。微生物。 3 (2012)。

ヤン、Ｙら。アナモックスを接種した 3 つの異なる廃水処理システムにおける複雑な微生物窒素循環ネットワーク。水耐性 168、115142 (2020)。

記事 CAS Google Scholar

Irisa, T.、Hira, D.、Furukawa, K.、Fujii, T. アナモックス細菌のヒドロキシルアミン酸化還元酵素によって触媒される一酸化窒素の還元。Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．バイオエンジ。 118、616–621 (2014)。

記事 CAS Google Scholar

Gori, F.、Tringe, SG、Kartal, B.、Machiori, E. & Jetten, MS Candidatus "Brocadia fulgida" におけるアナモックス代謝のメタゲノム基礎。生化学。社会トランス。 39、1799–1804 (2011)。

記事 CAS Google Scholar

Oseki, M.、Ali, M.、Shinyako-Hata, K.、Satoh, H. & Okube, S. ヒドロキシルアミン依存性嫌気性アンモニウム酸化 (anammox) by Candidatus Brocadia sinica。環境。微生物。 18、3133–3143 (2016)。

記事 CAS Google Scholar

ショウ、DR 他。アナモックス細菌による細胞外電子伝達依存性のアンモニウムの嫌気性酸化。ナット。共通。 2058年（2020年）11月。

記事 ADS CAS Google Scholar

Seviour, TW、Lambert, LK、Pijuan, M. & Yuan, Z. Candidatus "Competitibacter phosphatis" を濃縮することにより、好気性顆粒中の重要な構造エキソ多糖の合成を選択的に誘導します。応用微生物。バイオテクノロジー。 92、1297–1305 (2011)。

記事 CAS Google Scholar

Strous, M.、Heijnen, JJ、Kuenen, JG & Jetten, MSM ゆっくりと増殖する嫌気性アンモニア酸化微生物の研究のための強力なツールとしてのシーケンスバッチリアクター。応用微生物。バイオテクノロジー。 50、589–596 (1998)。

記事 CAS Google Scholar

ストラウス、M. et al. 欠けている岩栄養体は新しいプランクトミセテスであると特定されました。 Nature 400、446–449 (1999)。

記事 ADS CAS Google Scholar

LA ベレシェンコ、AJM スタムス、ユーベリンク GJW & ファンロースドレヒト、MCM 逆浸透膜上のバイオフィルム形成は、Sphingomonas spp.によって開始され、支配されます。応用環境。微生物。 76、2623–2632 (2010)。

記事 ADS CAS Google Scholar

Douterelo, I.、Sharpe, R. & Boxall, J. 塩素化実験用飲料水配水システムにおけるバイオフィルム形成の初期段階における細菌群集動態: 飲料水の変色への影響。Ｊ．Ａｐｐｌ．微生物。 117、286–301 (2014)。

記事 CAS Google Scholar

ルメール、R. 他 ANITA™ Mox プロセスによる主流の脱アンモニア。手順水環境。 FRB。 2014、2183–2197 (2014)。

記事 Google Scholar

Pynaert, K.、Smets, BF、Beheidt, D. & Verstraete, W. 生体触媒の逐次添加による独立栄養窒素除去リアクターの起動。環境。科学。テクノロジー。 38、1228–1235 (2004)。

記事 ADS CAS Google Scholar

アグラワル、S.ら。主流の部分硝化アナモックス反応器における微生物群集の組成と動態に対する接種材料と反応器の構成の役割。微生物。開ける。 6、e00456 (2017)。

記事 Google Scholar

Lackner, S. & Horn, H. 有機負荷の高い一段階硝化アナモックス処理廃水に対する SBR と MBBR の性能と動作安定性の比較。環境。テクノロジー。 34、1319–1328 (2013)。

記事 CAS Google Scholar

ユウ、Y.-C.、ガオ、D.-W. & Tao, Y. Anammox は、異なる接種スラッジを使用したシーケンスバッチバイオフィルムリアクターでスタートアップを開始しました。応用微生物。バイオテクノロジー。 97、6057–6064 (2013)。

記事 CAS Google Scholar

ウェット、B.ら。好気性アンモニア酸化剤と嫌気性アンモニア酸化剤のシントロフィー。水科学テクノロジー。 61、1915–1922 (2010)。

記事 CAS Google Scholar

ラックナー、S.ら。本格的な部分硝化・アナモックス体験～応用調査。水耐性 55、292–303 (2014)。

記事 CAS Google Scholar

Malovanyy, A.、Trela, J.、Plaza, E. 部分硝化/アナモックスプロセスによる一体型固定膜活性汚泥 (IFAS) 反応器における主流の廃水処理。バイオリソース。テクノロジー。 198、478–487 (2015)。

記事 CAS Google Scholar

Seviour, T.、Wong, LL、Lu, Y.、Mugunthan, S.、Yang, QH、Segaran, U.、Bessarab, I.、Liebl, D.、Williams, R.、Law, Y.、Kjelleberg、 S. アナモックス細胞外マトリックス中の豊富なタンパク質による相転移は、細胞間の凝集とバイオフィルムの形成を媒介します。 mBio。 02052–20 (2020)。

Gao, D.、Liu, L.、Liang, H.、Wu, W.-M. 好気性粒状汚泥の特徴、粒状化のメカニズム、廃水処理への応用。クリティカル。バイオテクノロジー牧師。 31、137–152 (2011)。

記事 CAS Google Scholar

de Graaf、AAV、de Bruijn、P.、Robertson、LA、Jetten、MS & Kuenen、JG 流動床反応器における嫌気性アンモニア酸化微生物の独立栄養増殖。微生物学 142、2187–2196。

記事 Google Scholar

Kartal、B. et al. 嫌気性アンモニア酸化で生計を立てる方法。 FEMS 微生物。改訂 37、428–461 (2013)。

記事 CAS Google Scholar

Eaton, A.、Clesceri, LS、Rice, EW、Greenberg, AE、Franson, M. APHA: 水および廃水の検査のための標準方法。百周年記念版。 (APHA、AWWA、WEF、2005)。

カリフォルニア州シュナイダー、WS州ラズバンド、KWエリセイリ NIH Image to ImageJ: 25年にわたる画像解析。ナット。方法。 9、671–675 (2012)。

記事 CAS Google Scholar

Daims, H.、Nielsen, JL、Nielsen, PH、Schleifer, KH & Wagner, M. 廃水処理プラントで活動するニトロスピラ様亜硝酸酸化細菌の in situ 特性評価。応用環境。微生物。 67、5273–5284 (2001)。

記事 ADS CAS Google Scholar

リファレンスをダウンロードする

この研究は、リサーチセンターオブエクセレンスプログラムに基づくシンガポール国立研究財団と教育省、および国立研究財団 (NRF) からのプログラム助成金、プロジェクト番号 1301-IRIS-59 によって支援されました。シンガポール公共事業委員会 (PUB) の Larry Liew 氏とスタッフの週次一次排水収集にご協力いただき、また Eganathan Kaliyamoorthy 氏には固体分析の実施にご協力いただきましたことに感謝いたします。

ヤン・ルー

現在の住所: The Australian Center for Ecogenomics, School of Chemistry and Molecular Biosciences, University of Queensland, St Lucia, QLD, 4072, Australia

ティ・クイン・ゴック・グエン

現在の住所: シンガポール科学技術研究庁、138632、シンガポール

Yang Lu 氏と Gayathri Natarajan 氏も同様に貢献しました。

シンガポール環境生命科学工学センター、南洋工科大学、シンガポール、637551、シンガポール

ヤン・ルー、ガヤスリ・ナタラジャン、ティ・クイン・ゴック・グエン、サラ・スワ・ティ、クリティカ・アルムガム、トーマス・セビオール、ステファン・ヴェルツ、インギュ・ロー

水技術センター (WATEC) およびオーフス大学生物化学工学部、Universitetsbyen 36, 8000, Aarhus C, Denmark

トーマス・セヴィア

シンガポール環境生命科学工学センター、シンガポール国立大学、シンガポール、119077、シンガポール

ローハン・B・H・ウィリアムズ

南洋理工大学土木環境工学部、シンガポール、639798、シンガポール

ステファン・ヴェルツ

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

TS、YYL、YL が原稿を書いて実験を計画し、RW、YL、KA が配列データを分析し、GN、TN、ST が実験データを維持および収集し、YL と GN が実験データを分析しました。著者全員が論文の編集に協力しました。

トーマス・セビウールへの手紙。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

オープンアクセスこの記事はクリエイティブコモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされており、元の著者と情報源に適切なクレジットを表示する限り、あらゆる媒体または形式での使用、共有、翻案、配布、複製が許可されます。クリエイティブコモンズライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示します。この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、素材のクレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブコモンズライセンスに含まれています。素材が記事のクリエイティブコモンズライセンスに含まれておらず、意図した使用が法的規制で許可されていない場合、または許可されている使用を超えている場合は、著作権所有者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

Lu、Y.、Natarajan、G.、Nguyen、TQN 他。 N-生物変換中間体と有機炭素レベルを使用した、アナモックスの種分化とバイオフィルム付着戦略の制御。 Sci Rep 12、21720 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-26069-2

引用をダウンロード

受信日: 2022 年 10 月 19 日

受理日: 2022 年 12 月 8 日

公開日: 2022 年 12 月 15 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-26069-2

次のリンクを共有すると、誰でもこのコンテンツを読むことができます。

申し訳ございませんが、現在この記事の共有リンクは利用できません。

Springer Nature SharedIt コンテンツ共有イニシアチブによって提供

コメントを送信すると、利用規約とコミュニティガイドラインに従うことに同意したことになります。虐待的なもの、または当社の規約やガイドラインに準拠していないものを見つけた場合は、不適切としてフラグを立ててください。