1,2,3の修飾により抗バイオフィルム効果が増強

Scientific Reports volume 6、記事番号: 24289 (2016) この記事を引用

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メトリクスの詳細

生物付着は膜バイオリアクターの性能を妨げます。 この研究では、1,2,3-トリアゾールとパラジウム (Pd) ナノ粒子で修飾されたポリスルホン膜の防汚効果を調査しました。 修飾膜の抗菌・防汚効果について、単培養種バイオフィルム (点滴流バイオフィルムリアクター、DFR) および混合種バイオフィルム実験 (好気性膜リアクター、AeMBR) で評価しました。 1,2,3-トリアゾールおよびPdナノ粒子は、好気条件と嫌気条件の両方で緑膿菌の増殖を阻害しました。 単培養種のバイオフィルムマトリックス内の総多糖類の量の減少とともに、細菌の増殖の減少が観察されました。 修飾膜を AeMBR に接続すると、膜間圧力の上昇は非修飾膜よりも低くなりました。 これには、混合種バイオフィルムマトリックス内のタンパク質と多糖類の濃度の減少が伴いました。 バイオフィルム層内のバイオマス量も、修飾膜の存在下では低くなり、栄養素除去速度から評価されるリアクターの性能に悪影響はありませんでした。 16S rRNA 分析ではさらに、膜ファウリングの遅れが選択された細菌群の相対存在量の減少に起因すると考えられました。 これらの観察結果は、修飾された膜によって汚れの発生が減少することを総合的に示しています。

膜バイオリアクター (MBR) は、膜分離プロセスを組み合わせることで排水品質の向上が達成できるため、廃水処理に好ましいバイオテクノロジーとしてますます使用されています。 膜は、バイオリアクター内に触媒金属 (酸化マンガン、パラジウムなど) を保持するために使用することもできます。 触媒金属は、従来の活性汚泥プロセスでは容易に生分解されない汚染物質（医薬品およびパーソナルケア製品、殺生物剤、有機微量汚染物質など）の還元的水素化脱ハロゲン化を達成します。 これを実証するために、パラジウム (Pd) は、医薬品、殺生剤、ヨウ素化造影剤の還元的除去を達成するための触媒金属として使用されています1。 同様に、トリクロロエテン (TCE)2 を完全かつ効率的かつ迅速に除去するために、Pd を連続平板膜反応器で使用しました。 どちらの場合も、Pd は中空糸ナノ濾過膜の使用によって MBR 内に物理的に保持されるか、懸濁液の形で反応器システム全体に再循環されます。 しかし、これらのナノ粒子用の担体材料が不足すると、ナノ粒子の凝集と成長が起こり、その後の触媒効果の低下を引き起こす可能性があります 3,4。

あるいは、反応性表面積全体にこの触媒を均一に分布させるために、Pd 粒子を膜表面に埋め込むこともできます。 たとえば、Hennebel らは Pd 粒子をポリフッ化ビニリデン膜にカプセル化し、そのような改良膜コンタクターがジアトリゾエートで汚染された水の処理に使用できることを実証しました 5。 しかし、Pd 含有膜は原子炉の運転中に生物付着物の堆積を受けやすい可能性があります。 これは、強力な抗菌効果を示す銀や銅のナノ粒子などの一部の重金属とは異なり、Pd ナノ粒子は弱い選択的な抗菌効果しか持たないためです 10。 生物付着は、透過水生成の減少、膜間圧力の増加、膜モジュールの寿命の短縮を引き起こす可能性があるため、膜バイオリアクターの性能に特に悪影響を及ぼします11。 さらに、タンパク質や多糖類などの生物付着物により触媒表面が汚染され、触媒活性が低下する可能性があります。

この制限を克服する戦略は、機能的に活性な化学基を Pd カプセル化膜に組み込むことです。 このような機能的に活性な化学基の一例は、トリアゾール配位子である。 トリアゾールリガンドは、がん細胞に対して細胞毒性効果を示すことがわかっています12。 また、シトクロム P450 と相互作用し、真菌におけるエルゴステロールの生合成を阻害することもあります。 最終結果は、真菌細胞の膜結合酵素活性と膜透過性に悪影響を及ぼします 13,14。 さらに、トリアゾールリガンドは、C-55 イソプレノイドアルコールとビタミン K の生合成を阻害することにより抗菌効果を示しました。C-55 イソプレノイドアルコールの欠乏は、細菌の細胞壁と膜ポリマーの生合成に影響を与えると考えられます。 また、ビタミン K が不足すると、グラム陽性菌の電子伝達に悪影響を及ぼす可能性があります 15。

現在まで、高分子膜の防汚剤としてのトリアゾール配位子の使用を実証する研究は限られています。 以前の研究では、トリアゾール含有ポリマーが、ポリマー膜から回収された浮遊および付着した緑膿菌細胞の数に対して抑制効果があることが実証されていました 16。 抗菌効果は膜ファウリングの発生の遅延に関連していると推測されていますが、この研究では、膜ファウリングの遅延を達成するために稼働中のメンブレンバイオリアクターに抗菌膜を使用することは実証されていません。 この研究では、トリアゾール配位子が膜上で官能化されたときにどのように防汚効果を達成するか、またはトリアゾールと Pd の両方の存在下で相乗的な防汚効果が達成できるかどうかも評価していません。

この研究では、細菌の単一培養と複雑なバイオフィルム実験の両方で膜の汚れを最小限に抑えるために、1,2,3-トリアゾールで官能化されたPSU膜にPdを埋め込むことを提案します。 この研究ではまず、膜上で官能化されたトリアゾールの異なる濃度、つまり 23%、49%、および 94% を評価します。 これらの膜は、以降、PSU-TriN-23%、PSU-TriN-49%、および PSU-TriN-94% と呼ばれます。 第２に、パラジウムイオンまたはパラジウムナノ粒子を、９４％トリアゾールで官能化したＰＳＵ膜上に埋め込んだ（すなわち、それぞれＰＳＵ－ＴｒｉＮ－イオンまたはＰＳＵ－ＴｒｉＮ－ＮＰ）。 これらの修飾された膜がタンパク質、多糖類の濃度、および付着したバイオフィルムマトリックス中の無傷の細菌細胞の数に与える影響を調べ、それぞれの対照と比較しました。 さらに、微生物群集の撹乱の結果としての生物活性レベルの変化は、16S rRNA 遺伝子ベースのアンプリコン次世代シーケンスによって特徴付けられました。 この研究は、トリアゾールと Pd の両方で修飾された PSU 膜が高い防汚特性を示すことを実証し、そのような修飾膜で膜ファウリングの遅延がどのように起こるかを研究する際の多面的なアプローチを提供することを目的としています。

PSU-TriN-94% が Pd イオンでキレート化された場合を除き、PSU 膜のトリアゾール修飾により PSU 膜の親水性が増加しました (表 1)。 PSU-TriN-NPs 膜は、テストした他のすべての膜と比較して最も高い親水性 (47.7°) を示し、その範囲は 58.6° ～ 84.3°でした。 テストしたすべての膜の中で、PSU-TriN-NPs 膜の表面トポグラフィーが最も粗かった (Ra = 58.9)。 PSU-TriN-Ions 膜と PSU-TriN-NPs 膜は両方とも、PSU-TriN-23%、PSU-TriN-49%、PSU-TriN-94% 膜よりも約 3 倍高い算術平均粗さ (Ra) を示しました。 PSU-Tri-0% メンブレンよりも 9 倍高い表面粗さ (表 1、図 S1)。

PSU-TriN-0%、PSU-TriN-23%、PSU-TriN-49%、PSU-TriN-94%のバイオフィルムマトリックスに強く結合した微生物の生死比を共焦点顕微鏡で検査しました（図S2）。 。 PSU-TriN-0% 上のバイオフィルム マトリックスの生死比は、好気条件と嫌気条件の両方で 1 より高かった。 対照的に、PSU-TriN-23%、PSU-TriN-49%、PSU-TriN-94% の比率は 1 未満であり、それぞれ PSU-TriN-0% (1.24 インチ) よりも大幅に低いことがわかりました。好気条件では 1.36、嫌気条件では 1.36 (t 検定、P < 0.01) (図 1A、B)。 同様に、PSU-TriN-0% のバイオフィルム マトリックス中の無傷の細胞の数がフローサイトメトリーによって数えられ、好気条件と嫌気条件の両方でトリアゾール官能基化 PSU 膜と比較して有意に高いことがわかりました (t 検定、すべて P < 0.05) (図 S3A、B)。 具体的には、PSU 膜 (PSU-TriN-0%) のバイオフィルム内の生細胞数は、残りの 3 つの膜と比較して、好気条件では約 5 倍、嫌気条件では約 8 倍高くなりました。 さらに、総バイオフィルムと緩く結合したバイオフィルムの差として表される強結合バイオフィルム (図 S3A、B) は、最大 1.8 × 107 細胞/(mL・cm2) および 3.95 × 108 細胞/(mL) でした。 · 好気条件と嫌気条件の両方で、それぞれ PSU-TriN-0% で cm2)。 無傷の細胞の数は、PSU-TriN-23%、PSU-TriN-49%、および PSU-TriN-94% 膜で観察されたものよりも多かった。

さまざまな膜に付着した細菌の生死比。

(A) 異なる濃度のトリアゾールポリスルホン膜を好気条件でテストしました。 (B) 嫌気条件における 4 つの異なる濃度のトリアゾール ポリスルホン膜。 (C) PSU-TriN-94%、PSU-TriN-Ions および PSU-TriN-NPs 膜を好気条件で定量しました。 (D) 嫌気条件における PSU-TriN-94%、PSU-TriN-Ions および PSU-TriN-NPs 膜。

PSU-TriN-NP の生死比は好気条件で 0.26、嫌気条件で 0.52 でした。これは、Pd ナノ粒子の存在が好気条件 (t 検定、P = 0.00) および嫌気条件で生死比を大幅に低下させる可能性があることを示しています ( t 検定、P = 0.03)、PSU-TriN-94% と比較 (好気条件および嫌気条件でそれぞれ 0.77 および 0.86 の比) (図 1C、D)。 PSU-TriN-Ions 膜は、PSU-TriN-94% 膜と比較した場合、好気条件および嫌気条件における生死比をそれぞれ 0.43 および 0.48 にさらに低下させることができました (t 検定、P < 0.05) (図1C、D）。

好気条件と嫌気条件の両方で、緑膿菌 PAO1 は、PSU-TriN- 上のバイオフィルム マトリックス内で、好気条件では総多糖類 2.34 ± 0.20 μg/(mL ・ cm2)、嫌気条件では 3.25 ± 0.26 μg/(mL ・ cm2) を生成しました。膜0%。 どちらの条件でも、PSU-TriN-0% 上の多糖類の量は、トリアゾール修飾膜上の多糖類の量よりも有意に多かった。 (すなわち、PSU-TriN-23%、PSU-TriN-49%、PSU-TriN-94%) (t 検定、すべて P < 0.03) (図 2A、B)。 PSU-TriN-94%膜とPSU-TriN-NPs膜の間でも有意差が得られました（図2C、D、t検定、好気条件および嫌気条件でそれぞれP = 0.01および0.02）。 ただし、PSU-TriN-94% 膜と PSU-TriN-Ions 膜の間に有意差はありませんでした (t 検定、好気条件および嫌気条件でそれぞれ P = 0.12 および 0.13)。 具体的には、単培養バイオフィルムにおける多糖生成の低下は、3つのトリアゾール修飾膜上で緑膿菌PAO117によって生成されるエキソ多糖（Pel、Pslおよびアルギン酸多糖を含む）の濃度がPSU-TriN-0%膜よりも著しく低いためであった。有酸素条件（t 検定、P < 0.03）と嫌気条件（t 検定、P < 0.02）の両方（図 S4A、B）。 好気性 (t 検定、それぞれ P = 0.00 および 0.07) と嫌気性 (それぞれ P = 0.00 および 0.07) の両方で PSU-TriN-94% と比較した場合、PSU-TriN-NP ではエキソ多糖のさらに有意な減少が観察されましたが、PSU-TriN-Ions では観察されませんでした。 t 検定、それぞれ P = 0.01 および 0.84) 条件 (図 S4C、D)。

(A) 好気条件でのさまざまな濃度のトリアゾール膜、(B) 嫌気条件でのさまざまな濃度のトリアゾール膜、(C) PSU-TriN-94%、PSU-TriN-Ions および PSU に付着したバイオフィルム内の総多糖の定量-好気条件における TriN-NP、(D) 嫌気条件における PSU-TriN-94%、PSU-TriN-イオンおよび PSU-TriN-NP。

対照的に、トリアゾール修飾膜は、嫌気条件下で緑膿菌 PAO1 のタンパク質産生を有意に減少させるだけであり (t 検定、すべて P < 0.05)、好気条件下ではタンパク質の有意な減少は示されませんでした (図 3A、B) ）。 PSU-TriN-94%膜とPSU-TriN-IonsおよびPSU-TriN-NPs膜をさらに比較したところ、好気条件と嫌気条件の両方でタンパク質の発現に有意な差は見られませんでした（図3C、D）。

(A) 好気条件および (B) 嫌気条件で PSU-TriN-0%、PSU-TriN-23%、PSU-TriN-49%、および PSU-TriN-94% 上に確立されたバイオフィルム内のタンパク質。 (C) 好気条件および (D) 嫌気条件における PSU-TriN-94%、PSU-TriN-Ions、および PSU-TriN-NP 上に確立されたバイオフィルム内のタンパク質。

PSU-TriN-0%、PSU-TriN-94%、および PSU-TriN-NP を実験室規模の好気性膜バイオリアクター (AeMBR) に接続して混合バイオフィルム コンソーシアムを確立することにより、防汚効果についてさらに評価しました。 どちらの実行でも、PSU-TriN-NP は採取時点でより低い TMP を示しました。 説明すると、PSU-TriN-0% 膜と PSU-TriN-94% 膜は両方とも、実行 1 の操作の 29 日目と 28 日目にそれぞれ重大なファウリングに達しましたが、PSU-TriN-NP では限界に達しませんでした (図 S5A)。 実行 2 では、PSU-TriN-NP は 21 日目に PSU-TriN-0% が臨界ファウリングに達したとき、PSU-TriN-NP の TMP は 10 kPa に達しただけで、残りの 2 つの膜よりも低かった (図 S5B)。 3 つの膜はすべて、実行 1 と実行 2 の両方で平均化学的酸素要求量 (COD) 除去効率 95% を達成しました。

PSU-TriN-NP 上に付着したバイオフィルムの可溶性 EPS 中の多糖類の濃度は 48.1 ± 10.7 μg/cm2 でした。 この濃度は、実行 1 の PSU-TriN-0% (59.0 ± 5.4 μg/cm2) および PSU-TriN-94% (102.3 ± 29.0 μg/cm2) 膜上の量よりも大幅に低かった (t 検定、P =それぞれ 0.05 と 0.00)。 実行 2 では、PSU-TriN-0% 上の多糖類の濃度は 40.7 ± 12.0 μg/cm2 でした。 対照的に、PSU-TriN-NP では多糖が 5.86 ± 0.48 μg/cm2 に大幅に減少しました (t 検定、P = 0.00) (図 4A、B)。 さらに、AeMBR の保持液および透過液ストリーム中の多糖類の定量化により、保持液多糖類の量 (実行 1 では 11.4 μg/mL、実行 2 では 8.0 μg/mL) が透過液 (6.5 μg/mL、6.5 μg/mL) よりも高いことが示されました。 PSU-TriN-0%、PSU-TriN-94%、PSU-TriN-NP から、それぞれ、ラン 1 で mL、5.6 μg/mL、ラン 2 で 5.9 μg/mL、2.7 μg/mL、5.2 μg/mL ）、膜による一部の多糖類の拒否を示します（図S6A、B）。

ラン 1 およびラン 2 の PSU-TriN-0%、PSU-TriN-94%、PSU-TriN-NP に付着した可溶性細胞外高分子物質 (EPS) 中の多糖類およびタンパク質の定量。(A) ラン 1 の多糖類、(B) ) 実行 2 の多糖類、(C) 実行 1 のタンパク質、(D) 実行 2 のタンパク質。

PSU-TriN-NPs 膜に付着したタンパク質の濃度は、実行 1 で 34.14 μg/cm2 であり、他の 2 つの膜よりも有意に低かった (t 検定、P = 0.00 および 0.00) (図 4C)。 同様の結果がラン 2 でも得られました。ラン 2 で PSU-TriN-NPs 膜に付着したタンパク質の濃度は 4.40 μg/cm2 で、テストした膜よりも大幅に低かった (t 検定、P = 0.00) (図 1)。 4D）。 タンパク質の測定は、280 nm 検出器を使用する HPLC によってさらに検証されました。 HPLC クロマトグラムは、ラン 2 と比較してラン 1 の濃度が高かったにもかかわらず、3 つすべての膜の保持液および透過液ストリームで 0.93 kDa の単一ピークのタンパク質フラグメントが観察されたことを示しました (図 S7)。 3 つの膜のバイオフィルム マトリックスは、保持液および透過液の流れで観察されたものとは大きく異なりました。 メンブレン上のタンパク質フラグメントのプロファイルは、ラン 1 では 0.15 kDa ～ 661.7 ± 40.2 kDa の範囲の分子量 (MW) を持っていました。ラン 2 では 661.7 kDa MW のみが PSU-TriN-0% メンブレン上で検出され、残りのパラジウムは検出されませんでした。修飾された膜には検出可能なフラグメントはありませんでした (図 S7)。

PSU-TriN-NPs膜に付着したバイオフィルムマトリックス中の平均ATP濃度は、ラン1では約133.59±21.4pmol/cm2、ラン2では116.60±18.37pmol/cm2でした（図5A、B）。 PSU-TriN 膜上の Pd ナノ粒子の存在により、実行 1 と実行 2 の両方で ATP 濃度が大幅に減少しました (t 検定、P = 0.00)。 PSU-TriN-0% 膜および PSU-TriN-94% 膜の平均 AI-2 濃度は、それぞれ 3.18 および 3.88 nmol/cm2 でしたが、実行 1 の PSU-TriN-NPs 膜では 0.72 nmol/cm2 に減少しました（図 2）。 5C）。 実験 2 では、PSU-TriN-0% 膜中の平均 AI-2 濃度は、PSU-TriN-94% 膜および PSU-TriN-NPs 膜で検出された濃度よりそれぞれ 6 倍および 24 倍高かった（図 5D）。

PSU-TriN-0%、PSU-TriN-94、および PSU-TriN-NP に取り付けられた EPS における ATP および AI-2 の測定。

(A) 実行 1 の ATP 濃度。 (B) 実行 2 の ATP 濃度。 (C) ラン 1 の AI-2 量。 (D) AI-2 ラン 2 の量。

PSU-TriN-0% 膜上に 94% 濃度のトリアゾール (つまり PSU-TriN-94%) と Pd ナノ粒子 (つまり PSU-TriN-NP) が存在すると、異なる微生物群集が生じました (図 S8、ANOSIM、R)実行 1 では = 0.889、実行 2 では R = 0.815、P = 0.1)。 たとえば、バイオフィルムマトリックスで検出された主要なグループである未分類のアシドバクテリア Gp4 の相対存在量は、実行 1 の PSU-TriN-NP 上の微生物群集全体の 12.4% を占めました。この相対存在量は、実行 1 の PSU-TriN-NP 上の微生物群集全体の 12.4% を占めていました。 PSU-TriN-0%。 実行 2 では、同じ未分類のアシドバクテリウム Gp4 も、PSU-TriN-NP 上での相対存在量が PSU-TriN-0% より 52% 低かった。 別の優勢な属であるアシネトバクターは、トリアゾールと NP の存在によって減少しました。 相対存在量は PSU-TriN-0% で 6.2% であり、実行 1 と実行 2 ではそれぞれ PSU-TriN-NP の 3.6 倍と 2.4 倍でした。 PSU-TriN-NPs 膜を使用した場合、アシドバクテリウム、アシネトバクターおよびキチノファガセア科の相対存在量は低くなりました。 たとえば、アシドバクテリアに属する Blastocatella fastidiosa の存在量は、PSU-TriN-0% では相対存在量 10.0% で存在し、PSU-TriN-NP の存在量よりも 1.5​​ 倍高かった。 同様に、実行 2 では、PSU-TriN-NP におけるその存在量は、PSU-TriN-0% と比較して 1.9 倍減少しました (表 2)。 同様の結果が、アシドバクテリウム属（例えば、Blastocatella fastidiosa）、アシネトバクター属（例えば、Acinetobacter guillouiae）およびキチノファガ科（例えば、テリモナス・ルテア）に属する他の OTU についても得られます（表 2）。

この研究は、ポリマーPSU膜上のトリアゾールリガンドの官能基化が抗菌効果をもたらし得ることを系統的に実証した。 同じトリアゾール官能化膜上にパラジウムナノ粒子を結合させると（図S9）、研究室規模の好気性膜バイオリアクターに接続した場合、抗菌効果がさらに強化され、膜汚れの発生を遅らせることができます。

抗菌効果を達成するために重金属（一般に銀と銅ではあるがパラジウムは使用しない）を高分子膜に使用して抗菌効果を達成することは、以前の研究で提案されていた18、19、20、21。 例えば、Ag ナノ粒子は、正浸透膜やブロック共重合体膜上で官能基化すると、高い殺生物効果を示すことが報告されています 7、8、21。 抗菌効果を達成するために、銅ナノ粒子も薄膜複合膜上で機能化されました18。 膜に付着する無傷の細胞の量を抑制するためにトリアゾールリガンドを使用するという同様の提案もなされた。 例えば、Duong らは、ヒドロキシル官能化膜へのポリトリアゾールの使用を紹介し、そのような膜の抗菌効果と付着防止効果を示しました 16。 テジェロら。 また、トリアゾール官能基を含むコポリマーが多くの微生物（酵母、黄色ブドウ球菌、緑膿菌など）に対して高い殺生物効果を示すことも示しました22。

単培養細菌モデルを使用して修飾膜の抗菌効果を評価した研究とは異なり、この研究は、そのような修飾膜の抗菌および防汚効果の背後にあるメカニズムを理解するための多面的なアプローチを提供しました。 まず、トリアゾールリガンドは、膜に付着した細菌の生死比を大幅に減少させることができます (図 1)。 同様に、リガンドは、好気条件と嫌気条件の両方で、バイオフィルムの緩く結合した部分と全体の両方で細菌の増殖を効果的に阻害しました（図S3）。 これは、バイオフィルムの緊密に結合した部分に比較的大きな部分の無傷の細胞があった未修飾の PSU-TriN-0% 膜とは対照的です (図 S3)。 この発見は、PSU-TriN-0% 膜が細菌による細胞接着を受けやすいことを示唆しています。これはおそらく、トリアゾールで官能化された膜と比較してこの膜の疎水性が比較的高いためであると考えられます 23 (表 1)。 しかし、PSU 膜上に官能基化されたトリアゾールの濃度を変えても、抗菌活性の程度には顕著な改善は見られませんでした。 これは、トリアゾール濃度の増加に伴う総多糖類、生死比、生細胞数の有意な減少が見られないことから例示されており、したがってトリアゾールの活性が抗菌効果の達成における制限因子ではないことが示唆されています。 代わりに、抗菌効果をさらに高めるには、パラジウムナノ粒子などの他の材料との組み合わせが必要です。

細胞増殖の阻害は、その後、バイオフィルムマトリックスにおける細菌性多糖類の生成に影響を及ぼしました (図 2A、B)。 多糖類とタンパク質は細胞外高分子物質 (EPS) の主成分として構成され、バイオフィルム マトリックスの乾燥重量の 90% を占めます 24。 したがって、多糖類の減少により、膜上でのバイオフィルム形成が遅れる可能性があります。 しかし、タンパク質に対する阻害効果は、単一培養および混合種のバイオフィルム実験では一貫していませんでした。 PSU-TriN-NPは、混合種バイオフィルムマトリックス中のタンパク質の量を大幅に減少させることができますが（図4C、D）、異なる濃度のトリアゾールリガンドの存在は、コントロールと比較してタンパク質濃度の有意な減少を引き起こしませんでした（図4C、D）。 3A）。 パラジウム（すなわち、イオン、NP）の添加も、単培養種バイオフィルム中のタンパク質濃度の有意な減少をもたらさなかった（図3C、D）。 単培養バイオフィルムの確立に LB ブロスが使用されたことを考えると、特定の場合にローリー法を使用してタンパク質含有量を定量する場合、この培地中の高濃度のタンパク質含有量がバックグラウンド干渉の一因となった可能性があります。 あるいは、タンパク質含有量の定量化に使用される方法 (ローリー法など) では、死んだ細菌細胞から溶解されたタンパク質と無傷の細胞膜に関連するタンパク質を区別できないため、タンパク質含有量が高いのは細菌の細胞膜に関連している可能性があります。修飾された膜は、死んだ細菌細胞から溶解された細胞内タンパク質でした。

代わりに、AeMBR実験におけるタンパク質含有量は、修飾膜とPSU-TriN-0%との間で有意な差を示した(図4)。 SMP のタンパク質濃度が低いことを考慮すると (図 S6)、単培養バイオフィルム実験とは異なり、Lowry 法に対する干渉は少ない可能性があります。 検証するために、混合種バイオフィルムマトリックス中のタンパク質断片を検出および測定するための代替方法として HPLC を使用しました。 HPLC の検出機構は液体クロマトグラフィーに基づいているため、Lowry 法のような制限を受けません。 この代替方法では、修飾膜上で測定されたタンパク質断片はほとんど検出できないことが示されました（図4および図S7）。したがって、トリアゾールおよびPd NPで修飾された膜はタンパク質の量を減少させることができることを示しています。

細菌細胞の増殖の阻害は、多糖類やタンパク質の生産に影響を与えるだけでなく、単位表面積あたりの ATP および AI-2 濃度の結果的な減少とも相関しており、どちらもバイオマスの量を示すパラメーターとして使用できます。 PSU-TriN-0% 上のバイオフィルムから抽出された可溶性 EPS 内のタンパク質をさらに比較すると、タンパク質の分子量分布が SMP で検出されたものとは明らかに異なることが観察されました (図 S7)。 これは、EPS の特定のタンパク質部分が SMP からのタンパク質の直接吸収によるものではなく、細菌の活動から生じたものであることを示唆しています。 検出可能なタンパク質断片が明らかに欠如していることから観察されるように、このような活性は修飾膜では明らかではなかった。 生物活性レベルの変化は、コントロール膜とは異なる修飾膜上の微生物群集の変化によるものと考えられます (図 S8)。 たとえば、未分類のアシドバクテリウム、未分類のキチノバクテリウム科、およびアシネトバクターの相対存在量は、トリアゾールおよびパラジウムの存在下では低かった。 さらに、対照膜と比較して、修飾膜の存在下では、テリモナス・ルテアがＯＴＵレベルで一貫して低いことが確認された（表２）。 以前の研究では、飲料水配水システムの銅管のバイオフィルムにキチノファガ科が豊富に存在することが報告されています25。 さらに、テリモナス・ルブラを含む未分類のキチノファガ科が好気性膜への付着に関与しており、その存在量は膜ファウリングの程度に応じて増加することが報告されている26。 同様に、アシネトバクター属およびアシドボラックス属は、バイオフィルム形成およびクオラムセンシングシグナル分子の豊富さと相関することが報告されている 27,28 (表 2)。 修飾された膜によるそのような細菌群の相対存在量の低下は、これらの膜上での細菌バイオフィルムの蓄積と形成が遅いことを示唆しています。

まとめると、膜に付着したバイオフィルムマトリックス内の無傷の細胞（すなわち、生細胞）の数、多糖類およびタンパク質含量の減少は、修飾された膜の抗菌効果を実証した。 これらの発見は、修飾膜を好気性 MBR に接続すると TMP の増加が遅くなることを説明し、膜が生物付着しにくいことを示唆しています。 これは、Pd イオンとナノ粒子を膜に添加した結果、表面トポグラフィーが粗くなったにもかかわらずです (図 S10、表 1)。 粗い表面を持つ膜は、粗さにより細胞と表面の相互作用の機会が増加し、細菌の付着が強化される可能性があるため、汚れがつきやすいことが以前に実証されました 23,29。 いずれにせよ、我々の観察は、トリアゾールと組み合わせた Pd の存在により、Pd ナノ粒子および程度は低いが Pd イオンが抗菌効果を有し、より粗い地形の影響を相殺するだけでなく、防汚効果も強化したことを示唆しています。

結論として、この研究の結果は、1,2,3-トリアゾール修飾が細菌の増殖を阻害し、多糖類とタンパク質の量を減少させることができることを実証しました。 Pd ナノ粒子が埋め込まれたトリアゾール膜は、抗菌効果において相乗効果を示しました。 好気性膜バイオリアクターに接続すると、修飾された膜は膜間圧力を下げ、膜生物付着プロセスを遅らせることができました。

この研究では 6 種類の PSU 膜が評価されました。 これらには、PSU 膜上に官能化された 4 つの異なる濃度のトリアゾール (つまり、0%、23%、49%、および 94%) が含まれており、PSU-TriN-0%、PSU-TriN-23%、PSU-TriN-49% と呼ばれます, この研究ではPSU-TriN-94%。 PSU-TriN-94% 膜のみが Pd イオンとナノ粒子を埋め込むことができるという事実により、パラジウム イオン (PSU-TriN-Ions) またはパラジウム ナノ粒子 (PSU-TriN-NP) のいずれかを含む PSU-TriN-94% 膜は、この研究では評価されました。 さまざまな濃度のトリアゾールを含む PSU-TriN は、公開されている方法 30 に基づいて合成されました。 簡単に説明すると、ポリスルホンはフェニル環の存在下でクロロメチル化され、銅(I)触媒によるアジド-アルキン付加環化によって1,4-二置換1,2,3-トリアゾール環が組み込まれました。 PSU-TriN-0%、PSU-TriN-23%、PSU-TriN-49%、および PSU-TriN-94% 膜は、非溶媒 (つまり水) 誘起相分離および N2 中の 20 wt% ポリマー溶液によって作成されました。 N-ジメチルアセトアミド (DMAc)。 すべての合成において、200μmもの厚さのポリマー溶液フィルムがポリエステル不織支持体上にキャストされた。 PSU-TriN-Ions および PSU-TriN-NPs 膜は、パラジウム源として酢酸 Pd(II) (Pd(OAc)2) を使用した錯体形成誘起相分離 31 によって作製されました。 簡単に言うと、ポリマー溶液（DMAc中20重量％PSU-TrN-94％）の200μmフィルムを不織布支持体上にキャストした。 そして、得られたポリマー溶液フィルムを、ＤＭＡｃ中のＰｄ（ＯＡｃ）２の３６ｍＭ溶液に３秒間浸漬して、パラジウムに富む最上層を形成した。 最後に、ポリマーを水浴に浸漬して、パラジウムを含まない多孔質支持体を形成した。 この時点で、PSU-TriN-Ions 膜が得られました。 追加の還元ステップを実行して、パラジウムイオンをナノ粒子に還元しました。 このステップは、PSU-TriN-Ions を 0.05M テトラヒドロホウ酸ナトリウム (NaBH4) 溶液に 5 分間浸漬することで構成され、PSU-TriN-NPs 膜が得られました。 この方法で合成された PSU-TriN-NPs 膜は、前駆体 (つまり、トリアゾール) が存在する高分子膜の最上層にのみよく分布していることが以前にわかっていました 32。 PSU-TriN-Ions膜ではなくPSU-TriN-NPの膜表面上のPdナノ粒子の均一な層をさらに図S10およびS11に示します。 すべての膜は、使用前に滅菌脱イオン水中に保管されました。

FEI Nova Nano 走査型電子顕微鏡 (SEM) と暗視野 Titan 80-300 CT 透過型電子顕微鏡 (TEM) (米国オレゴン州) をそれぞれ 5 kV と 300 kV で膜の表面を観察するために使用しました。 TEM 顕微鏡には、X 線エネルギー分散分光法 (EDS) 検出器、電荷結合素子カメラ、ポストカラム エネルギー フィルターも装備されていました。 SEM 用のサンプルを準備するために、膜サンプルの一部を空気中で乾燥させた後、平らなアルミニウムのスタブに固定しました。 厚さ３ｎｍのイリジウムを、Ｋ５７５Ｘ Ｅｍｉｔｅｃｈスパッタコータ（Ｑｕｏｒｕｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＫ）によって膜表面上にスパッタリングした。 TEM 用のサンプルを準備するために、膜を低粘度のエポキシ樹脂 (寒天 R1165) に埋め込み、60 °C で 24 時間硬化させました。 超薄切片 (100 nm) をウルトラミクロトーム (Leica EM UC6) で調製し、銅グリッド (180 メッシュ) 上に置きました。 原子間力顕微鏡 (AFM) を使用して、膜表面のトポグラフィーを特徴付けました。 風乾した膜をスライドガラス上に固定した。 AFMイメージングは​​、Bruker Dimension ICON装置（米国カリフォルニア州サンタバーバラ）によりソフトタップモードで実行されました。 各膜について、幅 5 μm、長さ 5 μm の画像がスキャンされました。 EasyDrop 形状分析装置 (Krüss、ハンブルク、ドイツ) を使用して周囲温度で静的モードで接触角を測定し、膜の親水性を定量化しました。 超純水をプローブ液体として使用し、3 つの異なる独立した試料から平均値を決定しました。

ドリップフローバイオフィルムリアクター（DFR）（Biosurface Technologies、ボーズマン、モンタナ州、米国）を使用して、膜上に単培養バイオフィルムを確立しました。 方法と条件は前述したとおりです 33,34。 簡単に説明すると、緑膿菌 PAO1 を 20 mL LB ブロス (Lennox) (Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国) に接種し、増殖培養物を 200 rpm のシェーカー インキュベーターで 24 時間、37 °C でインキュベートしました。 その後、細菌培養物を LB ブロスで 600 nm の光学密度 (OD600) が 0.07 になるまで希釈しました。 600 nm の波長でのこの OD 測定は、およそ 108 細胞/mL の細胞密度に相当します。 膜をポリカーボネートクーポンに貼り付け、二重にテストしました。 次に、クーポンをオートクレーブ処理した DFR の個々のチャネルに配置し、37 °C で 10 時間インキュベートしました。 嫌気条件では、代替電子受容体として硝酸塩の存在下で緑膿菌 PAO1 の増殖を確実にするために、1% 硝酸カリウム w/v を LB ブロスに添加しました 35。 膜は、好気条件下でLBブロスの連続0.8mL/分流の存在下で48時間培養した後、および嫌気条件下では増殖速度が遅いため72時間培養後に回収した。 DFR での有酸素条件での 2 回の実行と、無酸素条件での 2 回の実行を実施しました。

この研究では、膜上に混合細菌コンソーシアムを確立するために、以前に説明したのと同じ操作条件のアップフロー接続 (UA) AeMBR 26 も使用されました。 ３つの外部クロスフロー平坦シート膜モジュール（すなわち、ＰＳＵ－ＴｒｉＮ－０％、ＰＳＵ－ＴｒｉＮ－９４％、ＰＳＵ－ＴｒｉＮ－ＮＰ）を反応器に直列に接続した。 各膜は、18.5 時間の平均水圧滞留時間 (HRT) の下、6 ～ 8 LM-2 h-1 (LMH) の一定の膜貫通流束で操作されました。 3 つの膜のいずれかに重大な汚れが見られた場合、すべての膜を同時に回収しました。 可溶性微生物生成物（SMP）（各膜からの透過液および反応器内の保持液を含む）は、前述のプロトコールに基づいて操作全体を通じて毎週サンプリングされました26。 結果の再現性を確保するために、AeMBR で 2 回の実行が行われました。

DFR 実験では、各実行で重複したメンブレンが採取され、わずかに異なる方法で処理されました。 簡単に説明すると、1 つのメンブレンを 40 mL の 1X PBS で洗浄して緩く結合したバイオフィルムを除去し、その後メンブレンを共焦点顕微鏡分析のために保管しました。 もう一方の膜は、事前の洗浄ステップを行わずに 40 mL PBS に配置されました (つまり、緩く結合したバイオフィルムと強く結合したバイオフィルムの両方が収集されました)。 緩く結合したバイオフィルムと全体のバイオフィルムを含むチューブを、Q500 超音波処理装置 (Qsonica、米国コネチカット州ニュートン) で 2 秒の脈動間隔で振幅 25% で 3 分間個別に超音波処理し、バイオフィルムを懸濁液中に分散させました。 次いで、膜を懸濁液から取り出した。 懸濁液の一部は生細胞計数と Pel 多糖の測定に使用され、残りは多糖とタンパク質の特性評価のために 0.22 μm 酢酸セルロース膜で濾過されました。

AeMBR 実験では、20 cm x 2.5 cm の面積で採取した各膜を 3 つの等しい部分に無菌的に切断しました。 各部分は、廃水の流れの方向に基づいて、それぞれ入口、中間、出口と名付けられました。 各部分は、ATP 定量化および可溶性 EPS 測定のためにさらに細分化されました。 可溶性 EPS 測定の準備として、各膜サブポーションをそれぞれ 6 mL 1X PBS に浸しました。 前述したのと同様の方法で膜を超音波処理した。 次いで膜を除去し、残りの懸濁液を9400gで20分間遠心分離し、その後0.22μm酢酸セルロースで濾過した。 遠心分離後に得られた細胞ペレットは、DNA 抽出および微生物群集分析のために保管されました。

PSU 膜上に確立された単培養バイオフィルム内の生細胞を計数するために 2 つの方法が使用されました。 まず、Accuri C6 (BD Bioscience、ニュージャージー州、米国) でのフローサイトメトリーのために、1 mL の懸濁液を等分して 1X PBS で 5000 ～ 7000 倍に希釈しました。 LIVE/DEAD® BacLightTM 細菌生存率および計数キット (Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム) を使用して、メーカーのプロトコールに基づいて細菌を染色しました。 簡単に説明すると、それぞれ濃度 30 μM および 6 μM の 2X ヨウ化プロピジウム: Syto9 色素 300 μL を 300 μL の希釈懸濁液に添加し、フローサイトメトリーの前に室温および暗所で 15 分間インキュベートしました。 50μLの染色サンプルを35μL/分の速度で注入して、無傷の細胞壁を有する細胞(すなわち、生細胞)を数えた。 次に、強く結合したバイオフィルムを含む膜を、LIVE/DEAD® BacLightTM Bacterial Viability and Counting Kit で 20 分間染色しました。 倍率２０倍の対物レンズを備えたＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ７１０（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ＧｍｂＨ、イエナ、ドイツ）を使用した。 画像スキャンは、Ar/Kr レーザーからの 488 nm および 561 nm レーザー ラインを使用して実行されました。 各膜について 7 つの異なる画像が取得され、画像は Image J ソフトウェア 36 によって分析されました。 分析中、各画像は、それぞれ死細胞と生細胞の赤と緑のチャネルに従って 2 つの写真に分割されました。 次に、死細胞と生細胞を個別に計数し、生/死比を計算しました。

緑膿菌 PAO1 は、Pel、Psl、およびアルギン酸外多糖を生産することができます 17。 これらのエキソ多糖類は、緑膿菌によるバイオフィルムの構造的足場を提供するのに重要であり 37 、単培養バイオフィルム マトリックス内の主要な多糖類であると予想されます。 多糖類は、以前の説明に若干の変更を加えたコンゴ染色によって測定されました。 簡単に説明すると、分析前に懸濁液を短時間ボルテックスして内容物の均一性を確保しました。 均質な懸濁液 10 mL を 9400 g で 10 分間遠心分離し、上清を捨てました。 細胞ペレットを 10 mL の 40 mg/mL コンゴレッド LB ブロスに再懸濁し、37 °C のシェーカーインキュベーターで 90 分間インキュベートしました。 この後、懸濁液を再度９４００ｇで１０分間遠心分離し、上清のＯＤ４９０を測定した。 上清に吸収された総コンゴレッドを測定した。 5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL、40 mg/mL、および 80 mg/mL コンゴレッドを含む LB ブロスも OD490 によってテストし、上清中のコンゴ濃度を計算するための標準曲線を確立しました。

ＰＮおよびＰＳを決定する前に、上清をまず０．２２μｍシリンジフィルター（ＶＷＲ ＵＳ、ラドナー、ペンシルバニア州、米国）を通して濾過した。 PN は、Lowry 法 38 に基づいて、Total Protein Kit, Micro Lowry, Peterson's Modification (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, US) により 0 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg で定量されました。 /mL および 80 μg/mL のウシ血清アルブミン (BSA) を標準として 3 回測定しました。 BSA はニュージーランド産で、CAS 番号 9048-46-8 で凍結乾燥粉末として Sigma-Aldrich から市販されています。 PSはフェノール硫酸法により測定した。 0 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、および 80 μg/mL グルコースを標準として使用しました39。 SMP および EPS 中のタンパク質の分子量 (MW) 分析は、Xiong et al.26 によって記載された手順に基づいて、Water BreezeTM 2 HPLC システム (Waters Chromatography、Milford、MA、US) で実施されました。

アデノシン三リン酸 (ATP) とオートインデューサー 2 (AI-2) を定量して、膜上のバイオマスの量を測定しました。 寸法 1 cm x 2.5 cm の膜を 2 mL の脱イオン水の中に置き、2 秒の脈動間隔で 25% の振幅で 2 分間超音波処理しました。 懸濁液中の ATP 含有量は、陰性対照として脱イオン水を使用し、Advance ルミノメーター (Celsis、Westminster、London、UK) 上の Celsis Amplified ATP TM 試薬キットによって定量されました。 すべてのサンプルを 3 回繰り返して測定しました。 採取した膜の懸濁液からの AI-2 は、以前のプロトコル 26 に基づいて決定されました。

可溶性 EPS 抽出から得られたペレットのゲノム DNA は、UltraClean® Soil DNA Isolation Kit (MoBio Laboratories、米国カールスバッド) をわずかに変更して抽出されました 40。 16S rRNA 遺伝子の PCR 増幅は、515F (5'-イルミナ オーバーハング-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3') および 907R (5'-イルミナ オーバーハング-CCCCGYCAATTCMTTTRAGT-3') を用いて適用されました。 すべてのアンプリコンは約 550 bp の予想サイズであり、ネガティブ コントロールには増幅がありません。 PCRアンプリコンは、AMPure XPビーズ（Beckman Coulter、CA、USA）によってクリーンアップされました。 その後、メーカーのプロトコールに基づいて、Nextera XT Index Kit (Illumina Inc、San Diego、CA、USA) によって提供されるデュアルインデックスを付加するために Index PCR を実施しました。 インデックス付き PCR アンプリコンは、AMPure XP ビーズ (Beckman Coulter、カリフォルニア州、米国) によってクリーンアップされました。 等モル濃度のサンプルを混合し、Illumina MiSeq シーケンスのために KAUST Core lab に提出しました。 配列決定データは、その品質を考慮して処理され、以前の研究で指定されたのと同じアプローチで分析されました41。

3 種類の膜に付着した微生物群集の類似性の程度は、Primer E バージョン 742 によって分析されました。簡単に説明すると、細菌および古細菌の属の存在量が Primer E バージョン 7 に入力され、Bray を計算する前に平方根変換されました。 -カーティスの類似点。 次に、Bray-Curtis 類似度行列を使用して、多変量解析によって非計量しきい値多次元スケーリング (nMDS) プロットを構築しました。 nMDS 上の多変量パターンと >0.7 の相関を示した細菌標的をベクターとしてオーバーレイしました。 ANOSIM 分析を使用して、nMDS 上で観察されたクラスターが大きく異なるかどうかを判断しました。 他のすべての有意性検定は、Microsoft Excel 2013 および Prism 6 の両側 t 検定によって分析されました。

すべてのハイスループット シーケンス ファイルは、研究アクセッション番号 PRJEB12586 で欧州ヌクレオチド アーカイブ (ENA) のショート リード アーカイブ (SRA) に寄託されました。

すべての実験プロトコルは承認されたガイドラインに従って実行され、KAUST の施設内バイオセーフティおよび生命倫理委員会によって承認されました。

この記事を引用する方法: Cheng, H. et al. ポリスルホン膜上の1,2,3-トリアゾールおよびパラジウムナノ粒子の修飾により抗バイオフィルム効果が強化されました。 科学。 議員6、24289; 土井: 10.1038/srep24289 (2016)。

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著者らは、技術的な支援と指導をしていただいた Moustapha Harb 氏と Yanghui Xiong 博士に感謝の意を表します。 著者らは、STEM-EDX 画像を取得する際に技術支援を提供してくださった KAUST イメージングおよび特性評価コアラボの Manuel A. Roldan 博士に心から感謝の意を表します。 この研究は、P.-Y に授与された KAUST CCF 資金提供 FCC/1/1971-06-01 によって支援されています。 ホンさん。

中国科学院重慶グリーン・インテリジェント技術研究所、重慶、401122、中国

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ホン・チェン & ペイイン・ホン

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イフイ・シエ＆スザナ・ヌネス

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ルイス・フランシスコ・ヴィラロボス & クラウス・ヴィクトール・パイネマン

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HC と PYH が実験を考案し、設計しました。 YX と LFV は膜を製造し、膜の顕微鏡による特性評価を実施しました。 HC はサンプリングと実験を実施しました。 HC と PYH はデータを分析しました。 PYH、LS、KVP、SN は試薬/材料/分析ツール/人材を提供しました。 HC と PYH は原稿の執筆と図の作成に貢献しました。 すべての著者がこの投稿を読み、承認しました。

著者らは、競合する経済的利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Cheng, H.、Xie, Y.、Villalobos, L. 他ポリスルホン膜上の1,2,3-トリアゾールおよびパラジウムナノ粒子の修飾により抗バイオフィルム効果が強化されました。 Sci Rep 6、24289 (2016)。 https://doi.org/10.1038/srep24289

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受信日: 2016 年 2 月 24 日

受理日: 2016 年 3 月 24 日

公開日: 2016 年 4 月 12 日

DOI: https://doi.org/10.1038/srep24289

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応用微生物学とバイオテクノロジー (2017)

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