超安定かつ可逆的に光スイッチ可能な蛍光タンパク質の合理的な設計

Scientific Reports volume 6、記事番号: 18459 (2016) この記事を引用

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光変換可能な蛍光タンパク質は、いくつかのナノスコピー手法の中心となっています。 しかし、酸化状態を維持する細胞コンパートメントでの超解像イメージングを可能にする利用可能なバリアントはまだありません。 今回我々は、細菌のペリプラズム内で折りたたまれて光スイッチングできる2つの可逆的にスイッチング可能な蛍光タンパク質、rsFolderとrsFolder2の合理的設計を報告する。 rsFolder は、Superfolder-GFP と rsEGFP2 のハイブリダイゼーションによって設計され、前者の高速フォールディング特性と後者の高速スイッチングを継承しましたが、スイッチング コントラストが低下しました。 rsFolder と rsEGFP2 のスイッチング機構の構造的特徴付けにより、発色団のシス-トランス異性化のさまざまなシナリオが明らかになり、スイッチング コントラストが向上し、RESOLFT ナノスコピーに適した rsFolder のバリアントである rsFolder2 の設計が可能になりました。 rsFolders は大腸菌ペリプラズムで効率的に発現させることができ、これまで観察できなかった細胞コンパートメントに局在するタンパク質のナノスケール研究への扉を開きます。

超解像顕微鏡による生細胞の細胞内詳細のナノスケール視覚化は、多くの場合、遺伝的にコードされたマーカーとして「光変換可能な」蛍光タンパク質 (PTFP) の利用に依存しています1。 したがって、生化学的または光物理的特性が改善された PTFP の操作により、多種多様なナノスコピー アプローチの開発が促進されました 2,3。 特に、RESOLFT (可逆可飽和光学蛍光遷移)4、非線形 SIM (構造化照明顕微鏡)5、または pcSOFI (フォトクロミック確率光学変動イメージング)6 などの方法は、蛍光と蛍光の間を繰り返し切り替えることができる可逆的に切り替え可能な蛍光タンパク質 (RSFP) を活用しています。 (「オン」) 状態と無蛍光 (「オフ」) 状態です。 いわゆる「ネガティブスイッチング」緑色 RSFP では、オンからオフへの遷移はシアン光 (~490 nm) による照明時の蛍光発光と競合しますが、オフからオンへの遷移は紫色光 (~490 nm) による照明に即座に応答します。 405nm）。 ネガティブ RSFP のサブファミリーは、最初は Dronpa7 とその変異体 8,9 で構成され、rsCherryRev10、rsTagRFP11、mGeos12、バイフォトクロミック IrisFP13 および NijiFP14 などの花虫類 (サンゴやイソギンチャク) 起源の他のタンパク質が徐々に濃縮されました。 しかし、生細胞におけるRESOLFTナノスコピーの開発には、（光損傷を最小限に抑えるため）低い照明パワーでも効率的にスイッチングし、（コントラストを最大限に高めるために）オフ状態で最小限の残留蛍光を表示し、（コントラストを最大化するために）スイッチング疲労に対して高い耐性を持つRSFPが必要です。多数の連続したオンオフ スイッチング サイクルを維持します)。 ヒドロ虫類（クラゲ）由来の蛍光タンパク質、特によく知られているEGFPから遺伝子操作された変異体がこれらの要件を満たすことができ、rsEGFP15およびrsEGFP216が誕生することが判明した。 ごく最近、定向進化によって得られた rsEGFP の変異体が成熟し、哺乳動物細胞のサイトゾルでより効率的に発現することが報告されました 17。 Padron8 から進化したポジティブスイッチャー Kohinoor18 や mEos3.119 から進化したネガティブスイッチャー Skylan-S など、光スイッチング特性が強化された花虫類起源の RSFP も紹介されました。

PTFP の集中的な開発にもかかわらず、一部の細胞下部構造、特にペルオキシソーム、小胞体、ミトコンドリアの膜間腔、細菌のペリプラズムなど、酸化的折り畳みが起こるコンパートメントは、ナノスケールではほとんど研究されていません。 これらのコンパートメントには、薬物の取り込み、エネルギー生成、酸化代謝などに関与する多数の重要な高分子がまだ存在しています。 超解像分野におけるこのギャップの主な理由は、蛍光タンパク質が一般に酸化性の高い環境では適切に折りたたまれて発光できないことです20。 したがって、生細胞内のそのようなコンパートメントの超解像イメージングを容易にするためには、酸化的折り畳みが可能な PTFP の開発が必要です。

グラム陰性菌のペリプラズムは、細胞の入り口ホールとも呼ばれ、その総体積の 20 ～ 40% を占め 21、細胞分裂、環境シグナル伝達、細胞輸送などの重要なプロセスに関与しています 22。 したがって、それは、抗生物質作用（例えば、ペニシリン結合タンパク質）および耐性（例えば、β-ラクタマーゼ、ポーリンおよび排出ポンプ成分）に関与する様々なタンパク質を宿主とする23,24。 したがって、ペリプラズムで起こる分子プロセスを理解することは、基本的かつ生物医学的な興味深いものです。 ペリプラズムでは、分泌タンパク質、ペリプラズムタンパク質、内膜タンパク質、外膜タンパク質の 4 種類のタンパク質が酸化的フォールディングに直面しています。 ほとんどの外膜タンパク質、分泌タンパク質、およびペリプラズムタンパク質は翻訳後様式で輸送され、一般に Sec 分泌経路を介して折りたたまれた状態で輸送されますが、ツインアルギニントランスロコン (Tat) 分泌経路を介して折りたたまれた状態で輸送されることはよりまれです 25,26。 内膜タンパク質は、細菌シグナル認識粒子（SRP）によるリボソームから出現した新生ポリペプチド鎖の認識と、膜に埋め込まれたSRP受容体への三者複合体の結合に続いて、翻訳と同時に挿入されます27。 SRP と Sec システムは協力して機能し、実質的な親水性ペリプラズムドメインを保持する膜タンパク質の正確な挿入を確実にすることができることが示されました 28。 また、一部のペリプラズムタンパク質は SRP 経路を介して移動します。 ペリプラズム GFP 蛍光は、Tat22 を介したフォールディング後の転座後に観察できますが、Sec を通した転座後の GFP の再フォールディングは、酸化環境における望ましくない分子間ジスルフィド架橋形成のため、ペリプラズム内部で問題があることが示されています 20。 これらの GFP 凝集体は非蛍光性ですが、強い細胞毒性を示しました 29。 対照的に、Superfolder-GFP20,22,30,31 は、高速成熟とフォールディング動態を実現するために操作された GFP バリアントであり、Sec を介した輸送後、特に SRP 経路を使用した場合のペリプラズムタンパク質局在研究が可能であることが示されました 30。 しかし、Superfolder-GFP は光変換できないため、超解像度イメージングには適していません。

ここでは、2 つの新しいスーパーフォールディング RSFP、rsFolder と rsFolder2 の合理的な構造ベースの設計を報告します。 どちらのRSFPも細菌のペリプラズム内で折りたたまれて効率的に光スイッチを行うことができ、そのような「敵対的な」コンパートメント内の巨大分子のナノスコピックライブイメージングへの扉を開きます。 具体的には、ここでは rsFolder2 が細菌ペリプラズムの RESOLFT イメージングに適していることを示します。

我々は、共通の「祖先」として GFP を共有する Superfolder-GFP と rsEGFP2 を純粋な合理的設計によってハイブリダイズさせて、大腸菌ペリプラズムの酸化環境で効率的にフォールディングできる可逆的に切り替え可能な変異体を提供できると推論した。 したがって、EGFP を rsEGFP2 (T65A、Q69L、V163S、A206K) に進化させる 4 つの点突然変異 (T65A、Q69L、V163S、A206K)16 を Superfolder-GFP で操作し、rsFolder と名付けた新しい PTFP を生成しました。 T65A 変異は、rsEGFP216 に光スイッチング能力を与えることが知られており、スーパーフォルダー GFP 発色団自体を標的としています。 他の 3 つの変異のうち 2 つは、GFP 祖先と比較して Superfolder-GFP ですでに変更されているアミノ酸位置 (163 および 206) を標的としています (補足図 S1 の配列アラインメントを参照)。 rsEGFP216 のスイッチングコントラストを高めるには 163 位のセリンが重要である一方、溶媒に面した 206 位のリジンが GFP 変異体に強い単量体特性を与えることが判明したため、rsFolder にこれらの rsEGFP2 変異を保持することを選択しました 32。 したがって、rsEGFP2と比較した場合、rsFolderは6つの点突然変異（S31R、N40Y、S100F、T106N、Y146FおよびM154T）を示し、そのうちの1つだけが発色団（Y146F）の近傍で発生します（図S1、図S2b）。

rsFolder と rsEGFP2 の光物理的特性は非常に類似しています (表 1、図 1、および図 S3)。 rsEGFP2と同様に、rsFolderは、精製された形態（図1a）と生細胞（図S4）の両方で効率的なネガティブフォトスイッチャーです。 2 つのタンパク質は、ほぼ同一の吸光度および蛍光スペクトル特性を示します (図 1b、c)。 rsFolder 発色団の pKa (pKa = 5.5) は、rsEGFP2 (pKa = 5.9) の pKa よりわずかに低くなります (図 S5、表 1)。 どちらのRSFPもSuperfolder-GFP（〜40分）よりも遅く成熟し、それぞれの半減期は〜2.5時間（rsFolder）および〜3時間（rsEGFP2）です（図1d、表1）。 rsFolderも単量体であり（図S6、表S1）、Superfolder-GFPと同じくらい迅速にリフォールディングします（図1e）。 したがって、光物理学的および生化学的データは、rsFolder が Superfolder-GFP の高速フォールディング特性と rsEGFP2 の高速スイッチング特性の両方を継承していることを示唆しています。 さらに、その蛍光発光は広い pH 範囲にわたって維持されます (図 S7)。

分光学的および生化学的特性。

スーパーフォルダー-GFP (オレンジ)、rsEGFP2 (紫)、rsFolder (シアン)、および rsFolder2 (ネイビー)。 (a) 低照度でのスイッチング サイクル (488 nm: 1.9 mW/cm2、405 nm: 2.2 mW/cm2)。 rsFolder は rsEGFP2 よりも早くオフになりますが、オフ状態ではより高い残留蛍光に達します (挿入図)。 rsFolder2 は、スイッチング速度とコントラストの点で rsEGFP2 と同様に動作します。 見かけ上の残留スイッチングは、405 nm レーザーによる直接蛍光励起のみによるものです。 (b、c) rsEGFP2 (紫) と比較した、rsFolder (b、シアン) および rsFolder2 (c、ネイビー) の励起および発光スペクトル。 （ d ）発色団成熟動態は、rsEGFP2、rsFolderおよびrsFolder2（Ala-Tyr-Gly）の発色団が同様の速度で成熟するのに対し、Superfolder-GFP（Thr-Tyr-Gly）の発色団はより速く成熟することを示しています。 エラーバーは、三重測定の標準偏差を表します。 (e) 塩酸グアニジンによるカオトロピック変性後のリフォールディング中の蛍光回復速度論。 蛍光シグナルは 25 °C で継続的に監視されました。 エラーバーは、三重測定の標準偏差を表します。 （ f ）rsEGFP2（紫）、rsFolder（シアン）、およびrsFolder2（ネイビー）のオン状態の最大吸光度での光スイッチオフ状態の熱緩和。 値については表 1 を参照してください。

rsFolder にはさらに独自の特徴があります。 まず、オフ状態の熱安定性（約64時間）はrsEGFP2の熱安定性よりも15倍高く（図1fおよび表1）、我々の知る限り、RSFPの中で前例のないものです。 また、rsFolder は、rsEGFP2 よりもオフスイッチング後に高レベルの残留蛍光を示し、スイッチングコントラストの低下につながります（図 1a、図 S4、および表 1）。 この特徴は、オフからオンへの量子収量の増加と、488 nmでのオフ状態のより高い消衰係数から生じ（表1、図S3）、RESOLFTイメージングを損なうと予想されます。 これらの違いについて考えられる説明は、2 つの RSFP の光スイッチが異なるメカニズムによって行われるということです。 この仮説をさらに実証するには、分子レベルの洞察が必要です。

Dreiklang 33 を除いて、ヒドロ虫起源のすべての RSFP は、花虫起源の RSFP と同様に、オフスイッチング時に発色団のシス-トランス異性化を受けることが提案されています 34。 この仮説は、rsEGFP17 の rsGreen0.7 バリアントに関する構造研究によって最近確認されました。 ただし、rsEGFP2 と rsFolder が同じメカニズムで光スイッチするかどうかは不明のままです。 オフ状態での rsEGFP216 と rsFolder の吸収スペクトルを検査すると、約 400 nm を中心とする広いバンドが明らかになります。 これは、どちらのタンパク質にも古典的な規則が適用されること、つまり発色団のプロトン化が異性化と共役していることを強く示唆しています。 rsFolder と rsEGFP2 のスイッチング機構を解明するために、オン状態とオフ状態の両方での結晶構造を解析しました (図 2 および表 2)。 オンからオフへの切り替えは、ファイバー結合された 488 nm レーザーによる結晶の照射によって引き起こされました。 モデルは、rsEGFP2 の場合は 1.45 Å (オン状態) および 1.50 Å (オフ状態) の解像度で、rsFolder の場合は 1.50 Å (オン状態) および 2.35 Å (オフ状態) の解像度でそれぞれリファインされました。 実験的なフーリエ差分マップは、両方のRSFPにおいて、オフスイッチングが実際に発色団のシス-トランス異性化の結果であるという証拠を提供します（図S8）。 しかし、我々の構造は、rsEGFP2、rsFolder、および花虫類 RSFP 原型である Dronpa の光スイッチング機構の間に大きな違いがあることを明らかにしています 35。 Dronpa および mTFP0.736 や IrisFP13 などの他のネガティブ RSFP では、切り替え時に発色団環境の劇的な構造再構成が観察されます。 シス立体配座の強固に H 結合した Glu144-His193-Glu211 三つ組は、トランス立体配座の Glu144-Arg66-Glu211 三つ組に置き換えられ、His193 または Arg66 のいずれかが、π スタッキングおよび p とのカチオン π 相互作用によって発色団を安定化します。 -ヒドロキシベンジリデン部分、それぞれ34． 対照的に、rsEGFP2およびrsFolderでは、そのようなH結合ネットワークの再構成は観察されず、構造変化は発色団フェノラートの近傍の環境に限定されます（図2および図S8）。

オン状態とオフ状態の rsEGFP2 と rsFolder の結晶構造。

rsEGFP2 (a) および rsFolder (b) について、発色団および周囲の残基の洗練されたモデルが示されています。 初期のオン状態は、色付きの炭素原子で示されています (rsEGFP2 と rsFolder はそれぞれ紫色とシアン色)。 オフ状態は灰色のカーボンで示されます。 ±4.5 σ で輪郭を描いた Fobs(off)-Fobs(on) 差分電子密度マップ (黄色: ネガティブ、青色: ポジティブ) は、蛍光状態 (シス コンフォメーション) から光スイッチ状態 (トランス コンフォメーション) への顕著な動きを示す原子を強調表示します。 。 水素結合 (2.7 ～ 2.9 Å) は破線で示されています。

花虫類の陰性RSFPでは、シス状態のヒドロキシベンジリデン部分との強い水素結合を維持するSer142の能力により、トランス状態の自由エネルギーが低下し、他の水素結合パートナーを見つけることもわかった。発色団の異性化35,37。 同様の状況がrsEGFP2でも観察され、ドロンパのSer142と同じ役割を果たすHis149（発色団フェノラートまでの距離：2.7Å）が、発色団のトランス状態で代理H結合パートナーとしてTyr146を見つけます。 この光スイッチング機構は、rsGreen0.717 について最近報告されたものと同じです。 注目すべきことに、これら3つのRSFPでは、オフ状態発色団のフェノラートがバレル足場とのすべての水素結合を失い、構造水分子とのみ水素結合しており、オン状態構造にはこれまで存在していません（図2a）。 。 ただし、rsFolder では大幅に異なるシナリオが見られます。ここでは、Tyr146 が、Superfolder-GFP から受け継いだ突然変異の 1 つである疎水性フェニルアラニンに置き換えられています。 したがって、rsFolder が示すスイッチング パターンは独特です。 オン状態では、シス発色団のフェノラート酸素は、水分子である Thr204 および His149 に水素結合します。 異性化により、最初の2つのパートナーとの相互作用は失われますが、His149とフェノラート酸素はH結合したままとなり、シス立体構造の鏡像である発色団のトランス立体構造が生じます（図2b）。 この非常に珍しいメカニズムにより、rsFolder のオフ状態の発色団がバレルの足場にしっかりと付着したままとなり、おそらくその例外的な熱安定性が説明されます。 rsFolder のオンからオフへの切り替えに関与する残基の数が限られていること、およびそれに伴う H 結合形成と破壊のカスケードが減少していることにより、rsFolder のオフからオンへの移行に対するエネルギー障壁が rsEGFP2 よりも高くなる可能性があります。

オン状態とオフ状態の rsEGFP2 と rsFolder の結晶構造は、観察された rsFolder のオフ状態のより高い熱安定性の明確な分子基盤を提供します。 rsFolder のスイッチング コントラストの低下は、構造的な観点から説明するのがさらに困難です。 rsFolder のオン状態とオフ状態の間に観察される独特の対称性が影響している可能性があります。 構造データは、2 つの RSFP のスイッチング機構の区別における 146 位のアミノ酸の中心的な役割も明らかにし、rsFolder の機構を rsEGFP2 の機構に合理的に進化させる、つまり Phe146 をチロシンに置き換える簡単な戦略を示唆しています。 。 したがって、rsFolder2 と呼ばれる rsFolder の F146Y 変異体が生成され、特性が解析されました。 予想通り、rsFolder2は、rsFolder（図1f）と比較して、より高いスイッチングコントラスト（図1a、図S4）とオフ状態の熱安定性の低下を示し、その光物理的挙動はrsEGFP2のそれに非常に近づきます。 同時に、Superfolder-GFPから継承された成熟（図1d）および再折り畳みの動態は、本質的にrsFolder2に保存されています（図1d、e）。 まとめると、これらの特性 (スイッチング コントラスト、光抵抗、成熟およびフォールディング) は、rsFolder2 が RESOLFT 顕微鏡を使用した細菌ペリプラズムのナノスケール イメージングに適した候補である可能性があることを示唆しています。

rsFolder と rsFolder2 がどちらも高速スイッチングで光疲労耐性のある RSFP であり、Superfolder-GFP と同様に in vitro でリフォールディングすることを確立したので、細胞内で、つまり細胞内で発現させた場合にそれらがフォールディングして光スイッチできるかどうかを調べました。大腸菌細胞のサイトゾル (pET15-b ベクター) またはペリプラズム (pET26-b(+) ベクター、Sec 経路)。 ここでは蛍光シグナル (505 nm) と光学濃度 (600 nm) の比として表される細菌細胞の輝度は、生細胞内に存在する折りたたまれた FP の総量を示します。 サイトゾル発現と比較すると、ペリプラズム発現試験ではすべてのクローンがより低い細菌細胞の輝度を示し、最も劇的な効果はrsEGFP2を発現する細胞で観察されました（図S9a）。 図 3 は、ペリプラズムに rsEGFP2 を発現している培養物が早期に死滅することを示しています。これはおそらく、折り畳まれていないタンパク質が蓄積して堆積して有毒な凝集物になるためと考えられます。 対照的に、rsFolderおよびrsFolder2のペリプラズム発現は細胞生存率に影響を与えません（図3a）。 ペリプラズム rsFolder および rsFolder2 を発現する細胞の輝度の低下は、ペリプラズムの体積が本質的に小さいことと、その全体的なタンパク質負荷が調節されていることに起因すると考えられます。 この仮説を検証するために、細胞のペリプラズム内容物とサイトゾル内容物を分離し、蛍光分析とゲル電気泳動によって各コンパートメントに存在するRSFPの量を評価しました（図S9b）。 この結果は、ペリプラズムにアプローチできるタンパク質の量は実際には限られているという仮説を裏付けています。 ちなみに、観察された蛍光の大部分（約70％）がペリプラズムRSFPに由来していることも確認している。 重要なことは、固体培地上で増殖させた細胞に対して行われたスイッチング実験により、rsFolderとrsFolder2のスイッチング効率が細胞内で保存されていることを確認したことです（図3bおよび図S4）。 データはまた、RSFP がペリプラズムに向けられた場合、光疲労耐性が同様であることを示しています。

細胞質およびペリプラズムの発現と切り替え疲労。

（ a ）自己誘導培地中の単一コロニーからの細菌の増殖、およびrsFolder、rsFolder2、およびrsEGFP2のさらなる細胞質およびペリプラズム発現を、それぞれ吸光度（赤）と蛍光（黒）で20時間監視しました。 エラーバーは、3 回の測定における標準偏差を表します。 ペリプラズムを標的とした rsEGFP2 の産生は、細菌の増殖の激しい停止に対応し、これはペリプラズムの詰まりによって引き起こされる細胞毒性によって説明できます。 (b) 生きた大腸菌細胞の細胞質およびペリプラズムで発現した rsEGFP2 と比較した、rsFolder および rsFolder2 のスイッチング疲労測定。 黒い点は、各スイッチング サイクルの最大オン状態蛍光を示します。 対応する近似された指数関数的減衰曲線は赤色で示されます。 破線は、さまざまな RSFP サンプルが初期蛍光の半分に漂白されるまでに達成できるサイクル数を示しています。

rsFolder と rsFolder2 がイメージングに使用できるかどうかを判断するように設定しました。 まず、サイトゾルまたはペリプラズムのいずれかで rsEGFP2、rsFolder、または rsFolder2 を発現している細胞を広視野イメージングによってイメージングしました（図 4a）。 サイトゾルで RSFP を発現している細胞は均一な蛍光分布を示しますが、ペリプラズム rsFolder または rsFolder2 を発現している細胞の画像では、明確に描写されたペリプラズムが見えます。 当然のことながら、ペリプラズム rsEGFP2 を発現する細胞は、ほとんど検出できないシグナルを示し、ペリプラズムの描写はありません。

広視野とリゾルフトイメージング。

(a) 細胞質またはペリプラズムのいずれかで rsEGFP2、rsFolder、および rsFolder2 を発現する固定大腸菌の代表的な広視野画像。 すべての画像は同じ照明条件を使用して取得され、同じダイナミック レンジでスケーリングされました。 スケールバー: 2 μm。 (b) ペリプラズムで rsFolder2 を発現する生きた大腸菌の RESOLFT イメージングと、対応する回折限界共焦点イメージ。 (c) グラフ I ～ IV は、(b) の矢印で示された位置でペリプラズムを横切るライン プロファイルを示しています。 各プロファイルは、30 nm 離れた 5 つの隣接する線の平均です。 スケールバー: 1 μm

次に、ペリプラズム rsFolder2 を発現する大腸菌細胞に対して RESOLFT 顕微鏡検査を実行しました。 最も狭い領域の測定から、ペリプラズムの解像度が約 70 nm であることがわかりました (図 4b、線プロット I)。 一部の細菌は、おそらくペリプラズム空間を占めるペプチドグリカンおよび関連タンパク質の存在により、不均質な構造を示しました（図4b、線プロットII-III）。 また、110 nmという短い距離で離れた2つの隣接する細菌のペリプラズムを区別することもできました（図4b、線プロットIV）。これは、回折限界イメージングと比較して大幅な解像度の向上を示しています。 RESOLFT 性能のベンチマークとして、HeLa 細胞のサイトゾルで rsFolder2 とケラチン 18 の融合を発現させたコントロールでも同様の解像度 (80 nm) が得られました (図 S10)15,16。 RESOLFT顕微鏡写真は、ペリプラズムの厚さが細胞間で大きく異なることを示しています（図4b）。 この観察を電子顕微鏡写真と関連付けると、ペリプラズムは一般にコロニー細胞（数十nm）よりも単離された細胞（最大数百nm）の方が大きいことが明らかになります（図S11a）。 ペリプラズムの不均質な性質とrsFolder2によって可能になる解像度の向上は、RESOLFT画像における外膜の出芽イベントと小胞形成である可能性のあるものの視覚化によってさらに証明されます（図S11b、cの矢印で示されています）38。 透過型電子顕微鏡写真でも同じ特徴が明らかになります（図S11b）。 したがって、我々の結果は、これまで電子顕微鏡によってのみ追跡可能であった複雑なペリプラズムおよび外膜プロセスのライブ蛍光超解像度イメージングへの扉を完全に開きます。

rsFolders は、酸化的折り畳み機能を備えた最初の 2 つの RSFP です。 我々は、どちらも細菌のペリプラズム内でフォールディングおよび光スイッチを行うことができ、rsFolder2 を使用して RESOLFT サブ回折画像を取得できることを示しました。 rsFolder が、小胞体、チラコイド膜、ミトコンドリアの膜間腔、外部媒体など、酸化的折り畳みが起こる他の原核生物または真核生物の細胞区画で使用できるかどうかはまだわかっていません 39。 第 2 世代の変異体 rsFolder2 は、輝度が低いにもかかわらず、rsFolder と比較してスイッチング コントラストが向上しており、RESOLFT に適した候補となっています。 このバリアントは、生細胞内のペリプラズムタンパク質のイメージングのためのパターン化活性化非線形 SIM40 や pcSOFI6 などの他の技術にも役立つ可能性があると予想されます。 rsFolder は RESOLFT イメージングには適応していませんが、pcSOFI やオフ状態での極めて高い安定性を利用した潜在的な手法など、他の超解像アプローチに役立つ可能性があります。 rsFolders の足場の光物理的特性をさらに微調整して、他の超解像度技術にさらに適合させることが考えられます。 たとえば、低速スイッチングおよび/またはレッドシフト rsFolder バリアントは、単一分子局在化顕微鏡法および/またはマルチカラー イメージング用に開発できます。 RESOLFT イメージングに特有の rsFolder2 は、合理的または方向付けられた進化によって、達成可能な解像度を高めるために進化する可能性があります。 そのような改善が目前にあるかどうかは、今後の研究によって決定されるでしょう。

大腸菌 DH5α 細胞をクローニングと DNA 増幅に使用し、大腸菌 BL21 (DE3) を発現に使用しました。 特に明記しない限り、すべての細菌培養物は、100 μg/ml アンピシリン (細胞質 rsFolder、rsFolder2 および rsEGFP2) または 30 μg/ml カナマイシン (細胞質 Superfolder-GFP およびペリプラズム rsFolder、rsFolder2 および rsEGFP2) を補充した LB 培地で増殖させました。 化学薬品は Sigma-Aldrich から購入しました。

Superfolder-GFP/pET-30 プラスミドと rsEGFP2/pQE31 プラスミドは、それぞれ Cécile Morlot 博士と Stefan Jakobs 教授からご提供いただきました。 rsFolder は、EGFP と比較した場合の rsEGFP2 の 4 つの重要な変異 (T65A、Q69L、A163S et V206K) を配列に導入することにより、Superfolder-GFP の構造に基づいて設計されました。 Eurofins MWG Operon によって合成された配列は、ヒトと大腸菌の両方の発現のために再帰的にコドン最適化され、哺乳動物細胞での潜在的な発現のために Kozak 配列が挿入されました。 さらなるクローニングの使用を容易にするために、最も一般的な制限部位が得られたコード配列から除去されました。 rsFolder2 は、rsFolder テンプレートを使用した指向性突然変異誘発によって取得され、rsFolder (F146Y) の単一点変異体です。 サイトゾル発現試験では、rsEGFP2、rsFolder、および rsFolder2 を pET-15b (NdeI 制限部位と BamHI 制限部位の間) にサブクローニングしました。 ペリプラズム発現試験では、Gibson アセンブリ法 41 を使用してタンパク質を pET-26b(+) にサブクローニングしました。 プラスミドDNAおよびPCR断片を、それぞれQiaprepスピンミニプレップキット(Qiagen)およびQiaquick PCR精製キット(Qiagen)を用いて精製した。 keratin18-rsFolder2 融合タンパク質をコードするプラスミドは、市販の pTagRFP-ケラチン ベクター (Evrogen、モスクワ、ロシア) 内の TagRFP のコード配列を rsFolder2 のコード配列 (制限部位: KpnI および NotI) で置き換えることによって生成されました。

N末端ポリヒスチジンタグに融合した蛍光タンパク質を大腸菌BL21(DE3)細胞で発現させた。 細胞溶解後、蛍光タンパク質をNi-NTAアフィニティークロマトグラフィー、続いてHiLoad 16/600 Superdex 75カラム(GEhealthcare、Freiburg、Germany)を使用するサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。 精製タンパク質を限外濾過により濃縮し、緩衝液（50 mM HEPES pH 7.5）中で平衡化した。 rsEGFP2 および rsFolder の結晶は、20 °C でハンギングドロップ蒸気拡散法によって得られました。 簡単に説明すると、タンパク質 (rsEGFP2 については 12 mg/ml、rsFolder については 10 mg/ml) および沈殿剤溶液 (rsEGFP2 については 0.1 M HEPES pH 8.1、1.7 M 硫酸アンモニウム、および rsFolder については 0.1 M Tris pH 8.5、20% PEG 3,350) を使用しました。 １：１で混合し、２μｌの液滴を生成し、これを沈殿剤溶液を含む１ｍｌのウェル上に置いた。 結晶は 1 ～ 7 日以内に現れました。

データ収集前に、オン状態の rsEGFP2 および rsFolder の結晶を、15% グリセロールを補充した母液に短時間浸漬することによって凍結保護し、その後液体窒素中で瞬間冷却しました。 オフ状態を生成するために、凍結保護後、液体窒素で瞬間冷却する前に、ファイバー結合 488 nm レーザーで結晶を約 1 分間照射しました。 X 線回折データセットは、欧州放射光施設 (ESRF) のビームライン ID23-242 (rsEGFP2) および ID2943 (rsFolder) で、それぞれ PILATUS 2M および PILATUS 6M 検出器を備え、100K で収集されました。 データは XDS/XSCALE を使用して処理、マージ、スケーリングされ、XDSCONV44 を使用して振幅係数が生成されました。 Superfolder-GFP (PDB ID: 2B3P) の X 線構造とプログラム PHASER45 を開始モデルとして使用し、分子置換法によって構造の位相を決定しました。 モデル構築は Coot46 を使用して実行されました。 手動再構築の各段階に続いて、エネルギーの最小化と個々の B 因子の調整が行われました。 リファインメントとマップの計算は、REFMAC47 と PHENIX48 を使用して実行されました。 データ収集と詳細化の統計を表 2 に示します。図は PyMOL49 を使用して作成されました。

沈降速度実験は、AnTi-50 ローターを使用し、XL-I 分析用超遠心分離機 (Beckman Coulter、米国) でローター速度 42,000 rpm、20 °C で実行されました。 濃度に応じて、55、110、または 420 μl のサンプルをそれぞれ、サファイア窓を備えた経路長 1.5、3、または 12 mm の Ti ダブルセクター センターピース (Nanolytics GmbH、ドイツ) にロードしました。 溶媒と参照バッファーは 50 mM HEPES pH 7.5 でした。 150mM NaCl。 280、488、または395 nmでの放射状スキャンと干渉光学系からのスキャンを監視しました。 データは、データ分析用の Sedfit ソフトウェア v14.6e (www.analyticalultracentrifugation.com) に実装されている標準的な方法を使用して処理されました。 緩衝パラメーター (特に、20 °C、s20w での沈降係数) は、プログラム Sednterp (sednterp.unh.edu) を使用し、密度 (ρ) と粘度 (η) を 1.008 g.ml-1 と仮定して計算しました。それぞれ1.05mPa.s。 沈降速度プロファイルは、沈降係数 (s)50 の連続分布 c(s) と非相互作用種モデルの枠組みの両方の観点から分析され、s と濃度、一方ではモル質量の実験値が得られました。一方、Mさん。 予測された部分比容積と屈折率の増加 (∂n/∂c) は、rsFolder では 0.733 ml.g-1 と 0.189、rsEGFP2 では 0.735 ml.g-1 と 0.190 であり、2 つのタンパク質がモノマーとして沈降することを示しています。 図は、Gussi v1.0.9e (biophysics.swmed.edu/MBR/software.html) を使用して作成されました。

吸収スペクトルは、Jasco V-630 UV/VIS 光分光計 (Easton、USA) を使用して記録しました。 励起（λem = 540 nm）および発光（λex = 480 nm）スペクトル、ならびにリフォールディング、成熟および発現動態を、Biotek Synergy H4 マイクロプレートリーダー（Winooski、バーモント州、米国）を使用して記録しました。 発光スペクトルは480 nmでの励起を使用して取得し、励起スペクトルは540 nmでの蛍光を測定して取得しました。 モル吸光係数は、Ward 法 51 を使用して決定されました。 蛍光量子収量は、フルオレセイン (ΦFL = 0.95) と比較して計算され、Williams らによって記載された方法を使用してタンパク質間で交差検証されました。52 pKa 値は、さまざまな FP のアニオン吸光度ピークを pH の関数として測定することによって決定されました。さまざまなバッファー [クエン酸 (pH 3.5)、酢酸ナトリウム (4.0 ～ 5.0)、MES (5.5 ～ 6.5)、HEPES (7.0 ～ 8.5)、CHES (9.0 ～ 9.5)]。 スイッチオフした RSFP の熱安定性は、1 ～ 5 日間 10 分ごとに時間の関数として吸収をモニタリングすることによって測定されました。 スイッチオフした FP の光誘起蛍光回復は、キュベットホルダーに光ファイバーを接続した CCD ベースの分光計 (AvaSpec-ULS2048、Avantes、Eerbeek、オランダ) を使用して 20 °C で測定しました。 希釈したタンパク質 (50 μl) を 50 μl の 3 窓キュベットに置き、488 nm (1.9 mW/cm2) で均一なレーザー励起を確保するために角型ディフューザー (Thorlabs、ED1-S50) をキュベットの前に置きました。 405 nm (2.2 mW/cm2)。 蛍光発光を 2 秒ごとに測定しました (rsEGFP2、rsFolder、および rsFolder2 については λem = 506 ± 4 nm、Superfolder-GFP については λem = 512 ± 4 nm)。

488 nmでの一定の照明はタンパク質のスイッチを切り、その蛍光を励起する役割を果たし、一方、405 nmでの交互照明は600秒ごとに150秒間使用され、オフからオンへの回復を促進しました。 蛍光シグナルの変化は、Duan et al.53 に記載されている方法の枠組みで MATLAB (The MathWorks Inc.、米国マサチューセッツ州ナティック) で分析され、スイッチング量子収量の正確な計算が可能になりました。

すべてのタンパク質を変性バッファー (8 M 塩酸グアニジン、1 mM DTT、50 mM HEPES pH 7.5) で 0.1 mg/ml に希釈し、65 °C で 10 分間加熱しました。 驚くべきことに、加熱を行わない濃縮尿素による処理では、これらの蛍光タンパク質を適切に展開するには十分ではありませんでした。 次いで、変性タンパク質を再生緩衝液(35 mM KCl、2 mM MgCl2、1 mM DTT、50 mM Tris pH 7.5、30% グリセロール)で10倍に希釈した。 各タンパク質について、25 °C での蛍光回復を追跡することによりリフォールディング速度を測定しました (すべてのタンパク質については λem = 485 ± 9 nm、rsFolder、rsFolder2、および rsEGFP2 については λem = 505 ± 9 nm、Superfolder については λem = 510 ± 9 nm) -GFP) 20 分間、毎分。 データ点は、時間 t に沿って、リフォールディング率である k の関数を使用してフィッティングされました。 tm、リフォールディング時間の中央値。 および によって得られる導出ラグパラメータ。 すべての実験は 3 回繰り返して実行されました。

成熟動態は、Moore et al.54 のプロトコールを用いて測定しました。簡単に言うと、50 ml の細菌培養物を 250 ml フラスコ内の LB 培地で光学密度 0.6 まで増殖させ、その後密封した 50 ml チューブに移しました。 これにより、タンパク質の発現は可能だが細胞分裂と発色団の成熟は停止する嫌気的環境を作り出すことができました。 IPTG誘導(1mM)後、タンパク質を室温で一晩発現させた。 次に、4℃で遠心分離によって細胞を回収し、5 mlの溶解バッファー（50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、pH 7.5 mM、DNAseIを補充した抗プロテアーゼカクテル1錠）に再懸濁し、超音波処理によって溶解しました。 遠心分離後、５０μＬの上清を２００μＬの再酸素化緩衝液（３５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ ２ 、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５）に添加した。 蛍光強度は、37 °C で約 8 時間、10 分ごとに記録されました。 すべての実験は 3 回繰り返して実行されました。

タンパク質発現の同期開始を確実にし、実験開始時に検出可能な吸光度または蛍光が存在しないことを保証するために、これらの発現テストでは細菌を自己誘導培地中で増殖させました。 簡単に説明すると、各クローンについて、単一の細菌コロニーを使用して 25 °C で 5 ml の自動誘導増殖培地 55 に接種し、さらに 1 ウェルあたり 100 μl で 96 ウェル プレートに分配しました。 OD が 0.6 に達するまで (約 8 時間)、炭素源としてグルコースを使用して細菌を増殖させ、その後、炭素源として乳糖に切り替えることでタンパク質の発現を開始し、OD (600 nm) と蛍光 (505 nm) の両方をモニタリングしました。時間の関数。 細菌細胞の輝度は、20 時間増殖後の蛍光値と OD の比として表されました。 細胞質およびペリプラズムの発現レベルは、以前に記載されているように細菌分画によってさらに定量化されました 56。 簡単に説明すると、誘導された細菌培養物を3,000 g、4℃で10分間ペレット化し、0.5 ml TSE緩衝液（200 mM Tris-HCl pH 8、500 mM スクロースおよび1 mM EDTA）に再懸濁し、氷上で30分間インキュベートしました。 ０．５ｍｌの氷冷水を加え、３０分間インキュベートした。 細胞をペレット化し、上清をペリプラズム画分として収集した。 ペレットを5mlのBugBusterタンパク質抽出試薬(Novagen 70921-3)に再懸濁し、さらに室温で30分間インキュベートした。 次に、溶解物を 4 ℃、16,000 g で 45 分間遠心分離し、上清を細胞質画分として収集しました。 細菌画分を SDS-PAGE 12% アクリルアミドゲルにロードし、クーマシーブルーを使用して視覚化しました。 各コンパートメントで折りたたまれたタンパク質を定量するために、ペリプラズムおよび細胞質画分を HEPES (pH 7.5) で 10 倍に希釈し、蛍光強度を記録しました。

生きている大腸菌コロニーのスイッチング疲労測定は、405 nm (RSFP のスイッチをオンにする) と 488 nm (RSFP のスイッチをオフにする) のレーザー光を交互に照射することによって実行されました。 光は 20 倍の対物レンズ (NA = 0.4) によってコロニーに焦点を合わせ、~0.5 kW/cm2 (488 nm) および ~0.1 kW/cm2 (405 nm) のパワー密度を提供しました。 各 RSFP では、100% の光スイッチングを達成するために必要なだけ照明を短く保ちました。 蛍光は PMT (光電子増倍管) で記録しました。

細菌培養物を、1% グリセロールを補充した TB 培地で OD 0.6 まで増殖させ、次に IPTG で 20 °C で一晩誘導しました。 誘導後、細胞をペレット化し、4% パラホルムアルデヒドで固定するか (広視野イメージングの場合)、または固定しない (RESOLFT イメージングの場合) 後、PBS で 2 回洗浄しました。 細胞スラリーの一滴を、キトサン (広視野イメージング用) または LB 寒天 (RESOLFT イメージング用) で事前にコーティングしたカバーガラス上に置き、スライドガラス上にマウントしました。

哺乳類細胞の実験では、HeLa 細胞をカバー スライド上に一晩播種しました。 トランスフェクションは、製造業者のマニュアルに従ってTurbofect (ThermoFisher Scientific)を使用して実施した。 1 日間のインキュベーション後、細胞をピコデント ツインシル シリコーン (ピコデント、ヴィッパーフュルト、ドイツ) でオブジェクト スライド上に接着し、染色を防ぎ、その後画像化しました。

広視野イメージング実験は、開口数 1.49 の 100X 油浸対物レンズとドリフト防止 NPS ノーズピース (Olympus) を備えた IX81 Olympus 倒立顕微鏡で実行されました。 サンプルは、円偏光 488 nm (Spectra-Physics、サンタクララ、米国) 300 μW、23.5 μm FWHM ガウス形状レーザー ビームによって照射されました。

ＲＥＳＯＬＦＴ顕微鏡検査は、開口数１．４の１００Ｘ油浸対物レンズを備えたＱｕａｄ Ｐ顕微鏡（Ａｂｂｅｒｉｏｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して実施した。 RESOLFT 画像は、各走査位置で次の照明シーケンスを適用することによって記録されました。まず、405 nm の光で照明することによって rsFolder2 をオン状態に切り替えました (2.2 ～ 2.5 μW で 30 μs)。 次に、ドーナツ型の 488 nm 光ビーム (14 μW で 640 ～ 670 μs) を使用して、焦点の周囲のタンパク質をオフ状態に切り替えました。 第三に、スポットの中心にある残りのオン状態タンパク質の蛍光シグナルを、488 nm 光による励起（5 ～ 7 μW で 10 ～ 30 μs）後、510 nm で記録しました。 ドーナツ型ビームによるオフスイッチングの前後に、スイッチングシーケンスに短い照明中断 (最大 60 μs) が導入されました。 走査ステップサイズは30 nmに設定されました。 イメージングパラメータに関する詳細情報は、表S2に提供されます。

透過型電子顕微鏡を使用して、LB 寒天固体培地と電子顕微鏡グリッドの間の隙間で増殖した大腸菌 BL21 DE3 細胞を視覚化しました 57,58。 簡単に説明すると、600 nm で光学密度が約 1 になるまで細胞を一晩増殖させました。 20 μL の 10 倍希釈細胞を LB 寒天培地上に置き、37 °C で 1 時間インキュベートした後、その上に電子顕微鏡グリッドを追加しました。 プレートを37℃でさらに3時間インキュベートした。 次に、EM グリッドを静かに取り外し、滅菌水の滴下で 6 回洗浄し、直接または 2% (w/v) ケイタングステン酸ナトリウムでネガティブ染色した後に画像化しました。 画像は、Gatan の Orius TM SC1000 CCD カメラを使用し、120 kV で動作する CM12 および Tecnai 12 LaB6 電子顕微鏡を使用し、公称倍率 22,000 倍および 45,000 倍で、低線量条件下で撮影されました。

この記事を引用する方法: El Khatib, M. et al. 細菌のペリプラズムの超解像度イメージングのための、超安定で可逆的に光スイッチ可能な蛍光タンパク質の合理的な設計。 科学。 議員6、18459; 土井: 10.1038/srep18459 (2016)。

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この作業では、FRISBI (ANR-10-INSB-05-02) および GRAL (ANR-10-LABX-49-01) のサポートを受けて、グルノーブル指導センター (ISBG: UMS 3518 CNRS-CEA-UJF-EMBL) のプラットフォームを使用しました。 ) グルノーブル構造生物学パートナーシップ (PSB) 内。 この研究に対する支援は、国立研究庁 (ANR-2011-BSV5-012-01 NOBLEACH から DB および ANR-12-BS07-0008-03 Multiclick から JPC) およびグルノーブル アルプ大学 (AGIR NanOxyd から VA) から行われます。 ）。 ゲッティンゲンにあるマックス プランク生物物理化学研究所の Tim Grotjohann 氏と Stefan Jakobs 氏には、RESOLFT 画像の取得とデータ処理、および洞察力に富んだ議論に対して高く評価されました。 分析超遠心実験の実施とデータ処理については、ISBG PAOL プラットフォームの Aline Le Roy 氏と Christine Ebel 氏、電子顕微鏡写真の収集については Daphna Fenel 氏にそれぞれ感謝しています。 電子顕微鏡施設は、ローヌ アルプ地域圏、ルシェルシュ医療財団 (FRM)、欧州開発地域財団 (FEDER)、CNRS、CEA、グルノーブル大学、EMBL、および GIS インフラストラクチャ アン バイオロジーによって支援されています。 、サンテ・エ・アグロノミー（IBISA）。 この研究で研究したタンパク質の溶液中の光スイッチングサイクルの測定にご協力いただいたMartin Byrdin氏とDuan Chenxi氏に心から感謝します。 原稿の校正と継続的なサポートをしていただいた Martin Weik に感謝します。 長期プロジェクト MX1464、MX1583、および MX1676 (IBS BAG) の下でビームタイムを提供してくれた ESRF に感謝します。 CEA、CNRS、大学による財政的支援。 グルノーブル・アルプス。 MEK は博士号によってサポートされています。 グルノーブル統合構造細胞生物学同盟 (GRAL) およびフランス原子力委員会 (CEA) からのフェローシップ。

大学グルノーブル アルプ、IBS、F-38044、グルノーブル、フランス

マリアム・エル・カティブ、アレクサンドル・マルティンス、ドミニク・ブルジョワ、ジャック・フィリップ・コレティエ、ヴィルジル・アダム

CNRS、IBS、F-38044、グルノーブル、フランス

マリアム・エル・カティブ、アレクサンドル・マルティンス、ドミニク・ブルジョワ、ジャック・フィリップ・コレティエ、ヴィルジル・アダム

CEA、IBS、F-38044、グルノーブル、フランス

マリアム・エル・カティブ、アレクサンドル・マルティンス、ドミニク・ブルジョワ、ジャック・フィリップ・コレティエ、ヴィルジル・アダム

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MEK、JPC、VA が計画した研究。 MEK、ADM、VA で調製されたサンプル。 MEK と VA は生化学的および光物理学的実験を実施し、データを処理しました。 MEK と VA は画像化実験を実施しました。 MEK、JPC、VA で処理された結晶学的データ。 MEK と VA は構造を改良しました。 MEK、DB、JPC、VA がデータを分析しました。 DB と JPC は、すべての著者からの意見を取り入れて原稿を執筆しました。

著者らは、競合する経済的利害関係を宣言していません。

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転載と許可

El Khatib, M.、Martins, A.、Bourgeois, D. 他細菌のペリプラズムの超解像度イメージングのための、超安定で可逆的に光スイッチ可能な蛍光タンパク質の合理的な設計。 Sci Rep 6、18459 (2016)。 https://doi.org/10.1038/srep18459

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受信日: 2015 年 10 月 28 日

受理日: 2015 年 11 月 11 日

公開日: 2016 年 1 月 6 日

DOI: https://doi.org/10.1038/srep18459

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