原始模倣は大腸菌の形態変化を誘発する | 南寧ピーコックプライド株式会社

Communications Biology volume 5、記事番号: 24 (2022) この記事を引用

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原始細胞の形態は広範な研究の対象となっています。球形はプレバイオティクスの研究では一般的に推定されていましたが、生細胞での実験的証拠はありませんでした。生きた細胞の形状が変化したかどうか、またどのように変化したかは不明です。今回我々は、桿菌である大腸菌を原始環境を模倣した資源利用体制に曝露させた。オレイン酸は、脂肪酸小胞がプレバイオティックな地球上に存在し、エネルギー資源として使用されていた可能性があるため、使いやすいモデルプレバイオティック栄養素として与えられました。 6 つの進化系統が、グルコースを含まないがオレイン酸小胞 (OAV) が豊富な条件下で生成されました。興味深いことに、適応度の増加は一般に、桿体から球体への形態変化、および細胞のサイズと面積対体積比の両方の減少と関連していました。変化した細胞の形状は、炭素利用とタンパク質の存在量のトレードオフに関係なく、OAV またはグルコースのいずれかで保存されました。ゲノムに存在する高度に分化した変異により、OAV が豊富な条件に適応する 2 つの異なる戦略、つまり細胞壁を直接標的とするか否かが明らかになりました。脂肪酸の利用可能性に適応するための大腸菌の細胞形態の変化は、原始的な球形の仮定を裏付けています。

原始細胞の形状を調べることは、細胞の物理的および化学的特徴を全体的に制限するため、生命の起源を理解するために非常に重要です1,2。生命の起源に関する研究は一般に、プレバイオティクス化学における分子構成要素による生化学反応と合成生物学における遺伝情報の本質に焦点を当てていました3,4,5,6。生命の起源と最後の普遍的共通祖先 (LUCA) に向けたさらなる発展に至るルートの可能性については、集中的に研究されてきました 7、8、9。単一ヌクレオチドからのポリヌクレオチド合成の成功 10 と小胞内での DNA/RNA 複製 11,12 により、生化学成分が原細胞内で機能するメカニズムが明らかになりました。合成ゲノム 13、14、15 および縮小ゲノム 16、17、18、19 の構築に成功したことにより、現代の細胞の最小限の遺伝的要件が調査されました。これらの研究は、おそらく原始細胞の構成要素と遺伝的要件に関する有益な洞察と貴重なモデルを提供しました。しかし、原始的な形態学はほとんど研究されていません。

原始的な細胞の形状は不明のままです。特定の形態、つまり形状および/またはサイズは、構成要素が適切に機能し、遺伝物質が生物学的機能を実行するための閉じた空間を提供するため、細胞生命にとって重要です。原始的な細胞生命を担う構成要素の単純さを考慮して、球状構造が想定され、生命の起源に関する研究において数十年にわたりモデル原始細胞に採用されてきました。これが、球形のコンパートメント、例えば小胞や液滴 22、23、24 が原細胞を模倣するために一般的に使用される理由です 25、26、27。しかし、なぜ原始細胞が球形だったのか、そして原始細胞がエネルギー的にあるいは熱力学的に球を好んだのかどうかについては、まだ未解決の疑問が残っている。原始細胞には細胞壁がなかったと想定されているため、ほぼ球形の原形質のように、球形になりやすいのかもしれません。さらに、細菌などの現代の細胞の形状は、ゲノム相同性のみに基づいて研究されています 28。実験的実証の 1 つとして、L 型細菌は細胞壁の欠陥により不規則な形態を示しました 29,30。現代の細菌のほとんどは膜合成機構を備えています 31。これは、いくつかの微生物属でその形状、たとえば桿状を維持するために進化の過程で生じたものに違いありません。したがって、進化した膜や細胞壁を持たない原始細胞は球形であった可能性があります 32 が、原始細胞の形状に関する実験的証拠が必要です。

このような実験的証拠を得るために、原始環境の資源体制を模倣することによって引き起こされる、実験室における現代の生きた細胞を用いた進化実験が、退化の試みとして行われてきた33。まず、原始環境で利用可能な資源を模倣する、使いやすいモデルのプレバイオティック栄養素としてオレイン酸小胞 (OAV) が追加されました。原始細胞の増殖のための原始環境の化学組成は依然として議論の余地がある 34,35。最初の細胞生命体は、生分解しやすい小分子がプレバイオティックスープで使い果たされると、成長のために周囲の脂肪酸小胞を消費すると考えられていました36,37。脂肪酸小胞は、おそらく生物以前の地球に存在する主要な成分であり 38、原始細胞のモデル膜として採用されました 39。脂肪酸小胞の代表的なモデルとして、オレイン酸小胞 (OAV) は、初期生命の炭素資源の 1 つとして使用される可能性があります。第二に、大腸菌は安定した棒状の細菌の中で最も代表的なものであるため、細胞モデルとして使用されます40,41。大腸菌の桿体からフィラメントへの形態変化は、飢餓に対するストレス反応として報告されており 42、これは大腸菌が不適応な資源利用に直面したときにその形状を変えることができることを示唆しています。さらに、大腸菌はオレイン酸ではほとんど増殖せず、これは他のモデル細菌、例えば枯草菌にとって致死的である43、44、45、46。この結果は、大腸菌の OAV (オレイン酸の誘導体として) への進化的適応が実験時間スケール内で達成可能であることを示しています。最後に、大腸菌の実験的進化では、一般的に使用されるグルコースに代わる唯一の炭素源として OAV が採用されました。本研究では、大腸菌が OAV が豊富な環境に適応するかどうか、またどのように適応するかを調査しました。また、この条件下での実験進化中に細胞の形態がどのように変化するかを評価しました。

実験室用大腸菌株 MDS42ΔgalK::Ptet-gfp-kan を細胞モデルとして使用しました。これは、MDS42 の IS を含まない小さなゲノムが正確なゲノム再配列解析に有益であり、染色体に組み込まれた gfp (緑色蛍光タンパク質) が細胞モデルとして実用的であるためです。細胞検出と集団分析のためのインジケーター。我々は、グルコースまたはOAVを補充した培地のいずれかで6つの大腸菌集団を約500世代進化させました（図1Aおよび補足データ1）。指数増殖期を維持しながら連続移入を実行し（補足図1A）、毎日の培養物をイメージングフローサイトメトリーに供して、細胞濃度、細胞形態、および細胞タンパク質の存在量を定量的に評価しました（補足図1B）。共通の始祖 (Ori) から始まる 6 つの系統 (L31、32、9 ～ 12) は、OAV の存在下で世代を重ねるごとに成長速度が徐々に増加しました (図 1A、上)。 6 つの集団 (L#) の共通して改善された適応度は、大腸菌細胞が炭素源として OAV を利用できることを示しており、これはおそらく脂肪酸小胞が豊富な原始のような環境への適応であると考えられます。比較すると、グルコースの並行実験進化（G31、32、9〜12）は、OAVグループで見られるものよりも高い増殖速度を示しましたが、OAVグループと同様の動態を示しました（図1A、下）。興味深いことに、進化した集団（Evo）と元の集団（Ori）の成長率の変化倍数がOAVの存在下で有意ではなかったため、OAVの存在下での適応度の向上の大きさはグルコースの場合と同等でした（図1B、上）。 OAV およびグルコースグループ (p = 0.1)。これは、原始環境の炭素利用可能性を模倣することによって誘発された、実験室における現代細菌の実験的進化が適用可能であり、炭素源として糖を用いた通常の環境での進化に匹敵することを実証した。

A 成長率の変化。さまざまな希釈率の 3 つの培養物のうち 1 つを、次の連続移入のために選択しました。選択した培養物の増殖速度を使用して、時間的変化を評価しました。時間変化の対数回帰は、赤い実線の曲線で表されます。 B 実験的進化によって媒介される成長と細胞の形状の変化。上部と下部のパネルは、それぞれ成長速度とアスペクト比の変化倍数を表します。倍率変化は、エンドポイント母集団 (L# および G#) と Ori の間の比率として計算されました。箱ひげ図は倍率変化の分布を示し、6 つの系統が白丸で示されています。統計的有意性は p 値で示されます。 C 細胞の形状が変化する。移入された細胞集団の細胞形状、すなわちアスペクト比を(A)に対して示します。平均値と標準偏差は、イメージングフローサイトメトリーに供された 10,000 個の細胞から計算され、それぞれ水平と垂直の黒い線で表されます。時間変化の対数回帰は、赤い実線の曲線で表されます。 OAV (L#) およびグルコース (G#) で進化した 6 つの系統の標識が示されています。

成長適合性の向上が形態学的変化と関連しているかどうかが分析されました。セルの形状は、セルの長軸と短軸の長さの比を表すアスペクト比によって評価されました。つまり、アスペクト比が 1 に近づくほど、セルはより球形になります。細胞集団の平均アスペクト比（L#）の緩やかな増加は、グルコースで進化した系統（G#）で起こったのとは異なり、OAVで進化した系統（図1C、上）では一般的に観察されました（図1C、上）。底）。実験の進化により、炭素源とは無関係にアスペクト比が上昇しましたが（Evo の Ori に対する倍率変化 > 1）、OAV の変化の大きさはグルコースの変化よりも有意に大きかった（p = 0.01）（図 1B、下）。。細胞形態は、単一細胞イメージングによってさらに確認されました（図2および補足図2）。グルコース（G#）中で進化した細胞は、Ori 細胞（図 2A）と同様の棒状形状を維持しました（図 2B）。対照的に、OAVで進化したものはすべてOriで進化したものよりも短く太く、OAVで成長したかグルコースで成長したかに関係なく、一部はほぼ球形でした（図2C）。これらの結果は、通常、グルコースを代謝しながらその形状を維持する棒状の大腸菌が、OAVに適応すると球形に近づくことを示しています。

グルコースとOAVの両方におけるOriの単細胞画像。 B グルコースまたは OAV のいずれかで進化した 6 系統 (C) を 2 つのサイズスケールで示します。スケールバーが示されています。 (C) の上部と下部のパネルは、それぞれ OAV とグルコースで新たに増殖した OAV で進化した系統を示します。

他の形態学的特徴、つまり細胞の表面積と体積の変動は進化中に発生しましたが、細胞の形状のみが適応度の増加と高度に調整されました（補足図3）。成長率の変化は、グルコースで進化した系統の相関が弱いのとは対照的に（図3Aおよび補足データ2）、OAVで進化したすべての系統で普遍的に見られたアスペクト比および長さの変化と高い相関があった（図3Aおよび補足データ2）。 . 3B および補足データ 3)。適応度の増加は細胞形状の変化と密接に関連しており、これは、OAV の消費には細胞が桿体から球体に変化する必要があることを示しています。全体として、原始環境の炭素体制を模倣した実験室環境は、脂肪酸小胞に囲まれた細胞の球形性の実験的証拠を提供し、これは生物以前の地球上に球形の原始細胞が存在するという推測を裏付けるものである。

成長と形態を表す 6 つの特徴のうち任意の 2 つの間の相関係数の統計的有意性がヒートマップに表示されます。黄色から青への色のグラデーションは、統計的有意性を示します。青と紫は非常に重要です。 6 つの機能は、成長、アスペクト、長さ、幅、logArea、logVol です。は、それぞれ成長速度、アスペクト比、相対細胞長 (L)、相対細胞幅 (W)、面積 (A) と計算された細胞体積 (V) の対数を表します。 OAV (A) またはグルコース (B) のいずれかで進化した 6 つの系統が示されています。計算されたデータは補足データ 2 および補足データ 3 にまとめられています。

OAVへの適応で達成される球形は、細胞がOAVとグルコースの両方の存在下で増殖した場合に安定しているように思われたため（図2C）、定常状態で球形を維持できるかどうかをさらに分析しました。 OAVで進化した6つのEvoの定常状態におけるアスペクト比は、培地中のOAVの濃度（0.035〜3.5 mM）に関係なく、すべてOriのアスペクト比よりも大きいままであり（図4A）、保存された変化を示しています細胞の形で。これらの Evo の細胞形状の変化は、グルコースを補給した条件下でも観察されました。これらの Evo のアスペクト比は、すべてのグルコース濃度 (0.105 ～ 10.5 mM、OAV はグルコースの 3 倍多くの炭素原子を持っているため) において、Ori のアスペクト比よりも大きいままでした (図 4B)。棒状から球状への細胞形状の変化は、炭素源に関係なく保存されました。実験的進化は指数関数的成長期内で行われたが、変化した形態は成長期とは無関係に固定される可能性が高い。

OAV (A) またはグルコース (B) の存在下での細胞の形状を平均アスペクト比で示します。 Ori と Evo は、それぞれ青色と無色の円で示されます。灰色の円 (明るい灰色から濃い灰色へのグラデーション) は 6 つの系統を示します。生物学的反復の標準誤差 (N > 5) が示されています。平均アスペクト比、平均細胞長、平均対数面積、および細胞集団の体積の箱ひげ図をそれぞれ (C–F) に示します。個々のテストは円で示され、補足図 4 のデータに対応します。成長率の中央値と平均は、それぞれボックス内の線と十字で表されます。統計的有意性は p 値として示されます。カラーバリエーションの意味を示しています。

さらに、OAVで進化した大腸菌細胞は、OAVの濃度に関係なく、Ori細胞よりも短くて小さいままでした（つまり、面積と体積）（補足図4、上）。グルコースのない条件でより小さいサイズへの変化は、グルコースが豊富な条件での実験の進化が大腸菌細胞をより大きく適応させる傾向があるという発見と一致していた47。進化系統とOAVの存在量が無視された場合でも、細胞形態の非常に重要で保存された変化が特定されました（図4C〜F、上）。ただし、OAV で進化した大腸菌細胞がグルコースで増殖すると、保存されたのは細胞の形状の変化だけでした (図 4C-F、下)。細胞の長さと細胞のサイズは、何らかの形でグルコースの濃度に依存していました（補足図4、下）。他の形態学的特徴ではなく球形への細胞形状の変化は、大腸菌が唯一の炭素源として OAV を使用するために非常に重要でした。これまでのところ、OAV の短期進化とグルコースの長期進化の両方が細胞サイズの変化を引き起こすため、OAV が分子機構を介した代謝を通じて細胞形態に影響を与えたかどうか、またどのように影響したかは不明です。あるいは、細胞形状の変化は、炭素源がグルコースからOAVに変化することによって引き起こされる大腸菌の原形質膜容量の変化に部分的に起因している可能性がある。なぜなら、そのような栄養変化による脂肪酸合成の変化は、細胞の細胞膜能力に影響を与える可能性があるからである。細胞エンベロープの容量、それによって細胞のサイズと形態に影響を与える49。

環境進化 50,51 や実験的進化 52,53 ではトレードオフが頻繁に発生するため、炭素利用における進化的トレードオフが特定されました。炭素利用効率は、保持容量、つまり単位炭素源あたりの最大細胞濃度（補足図5）によって定量的に表されました。 Evo（OAVで進化した）の運搬能力は、Oriの運搬能力と比較して、OAVでは大まかに増加し、グルコースでは減少を示しました（図5A）。トレードオフは炭素源の豊富さに依存し、これらの Evo 間でわずかに異なりましたが、三次多項式回帰による追加の理論分析により、炭素利用効率は OAV では大幅に改善されたが、グルコースでは減少または変化していないことが明らかに実証されました (補足図6)。

運搬能力。単位 (mM) 炭素源 (OAV またはグルコース) あたりの最大集団サイズ (細胞/mL) が表示されます。 Ori と Evo (OAV で進化) は、それぞれ青色と無色の円で示されています。灰色の円 (明るい灰色から濃い灰色へのグラデーション) は 6 つの系統を示します。生物学的複製の標準誤差 (N > 5) が示されています。 B 細胞タンパク質の豊富さ。細胞タンパク質濃度は対数スケールの GFP/V で表されます。 Ori と Evo (OAV で進化) は、それぞれ緑色と無色の円で示されています。明るい灰色から濃い灰色へのグラデーションは 6 つの系統を示しています。生物学的反復の標準誤差 (N > 5) が示されています。

収容力のトレードオフは、細胞タンパク質の豊富さのトレードオフに関連していました。細胞タンパク質の存在量は、染色体にコードされ、継続的に発現される緑色蛍光タンパク質 (GFP) によって報告されました 54。細胞タンパク質の豊富さのトレードオフは、炭素利用能力のトレードオフとは逆方向に起こりました。つまり、Evo の GFP 濃度は、Ori の GFP 濃度と比較して、OAV では減少しましたが、グルコースでは増加しました (図 5B)。 GFP 濃度の低下は、希釈効果による増殖速度の増加によって引き起こされる可能性があります 55。一方、GFP 濃度は、OAV で進化した大腸菌細胞の細胞サイズの減少により増加する可能性があります。 OAVの添加によりGFPの相対存在量だけでなく総量も減少したため（補足図7）、成長の増加によって引き起こされた希釈率の増加ではなく、タンパク質生合成（つまり、転写と翻訳）の減少でした。これらの Evo が炭素源として OAV を使用した場合、タンパク質濃度の低下が引き起こされました。フィットネスの向上は、OAV 摂取中の安価な炭素異化のための安価なタンパク質生合成に起因する可能性があります。

アスペクト比の上昇は、平均長さ、つまりセルの長軸が短くなった一方、幅は同じままであるため、セルの長さの変化によって引き起こされた可能性があります（補足図8）。細胞がOAVを利用するのを助けたのは、細胞幅によって媒介される拡散効果ではなく、細胞長の短縮に起因する細胞サイズの変化である可能性がある。セルの形状 (アスペクト比) に加えて、セルの表面積 (A) と体積 (V) も分析されました。面積対体積（A / V）比は、OAVの補充により大幅に減少しました（図6Aおよび補足図9）。これは、桿体から球体への細胞形状の変化により、細胞面積がOAVの補充よりも大幅に減少したことを示しています。セルの体積。球体は棒体よりも小さい A/V 比を示すと考えられていたため 56、理論的予測では、球体が環境からの小分子の拡散を妨げる可能性があることを示唆しています 57,58。より高い A/V 比を備えたロッド形状は、グルコースなどの小さな分子の利用には有利ですが、オレイン酸などの大きな分子の利用には有利ではないと考えられていました。あるいは、A/V 比が小さいため脂肪酸の利用が阻害されず 58、球形は OAV の使用に適していました。興味深いことに、Ori と Evos (OAV で進化) は両方とも、炭素源の置き換えに直面したときに A/V 比を増加させました。炭素源はそれぞれグルコースと OAV に適応すると考えられていました。これらを不適応条件下、つまりOAVのOriとグルコースのEvoで培養した場合、それらはすべて、適応のための第一選択戦略としてA/V比を上昇させた。ＥｖｏのＡ／Ｖ比は、グルコース中でのＯｒｉの比と同等になるまで、グルコース中で増加した（図６Ａ、黒色）。細胞が栄養のアップシフトに伴って大きくなることは知られていたが49,59、グルコースが豊富な状態がOAVで進化したEvoにとって栄養のアップシフトであるかどうかは不明であった。 OAV に適応した大腸菌細胞は、グルコースの拡散を促進し、グルコース利用を改善するために、OAV よりもグルコースの A/V 比が大きいことを好むと考えられます。 Ori の A/V 比は、有益ではありませんでしたが、OAV 補給下で増加しました (図 6A. 青)。ほとんどの系統が進化の初期段階で A/V 比の増加を示したため、A/V 比を上げることが適応のための最初の選択肢であるようでした（補足図 10）。

A 面積対体積比の箱ひげ図。 OAV (影付きボックス) またはグルコース (白抜きボックス) の存在下で増殖させた Ori (青) および Evos (黒) を示します。細胞集団（測定値）の平均面積対体積（A/V）比は円で示されています。平均 A/V 比の中央値と平均は、それぞれボックス内の線と十字で表されます。統計的有意性は p 値として示されます。 B グルコースの増殖率。青と黒はそれぞれOriとEvoを示します。繰り返し測定した成長率は円で示されています。成長率の中央値と平均は、それぞれボックス内の線と十字で表されます。統計的有意性は p 値として示されます。

さらに、わずかではあるが大幅に増加したA / V比はグルコース利用を改善できませんでしたが、グルコース濃度や進化系統に関係なく、グルコースの成長速度を増加させました（図6Bおよび補足図11）。進化のトレードオフが環境収容力では発生するが、成長適応性では発生しないことは非常に興味深いものでした。 OAV を使用するための適応により、OAV とグルコースの両方の成長適性が向上しました。これは、同じ大腸菌株内であっても、成長適性における進化的トレードオフ 60,61,62 に矛盾します 63。総合すると、これらの発見は、球形が膜合成のための物質とエネルギーを節約する可能性があり、これが資源に乏しい条件や細胞がエネルギーを消費する代謝を行う場合に有利であることを示唆している。初期の地球で脂肪酸小胞の資源が不足していれば、原始細胞は成長のために資源を節約し、球形の恩恵を受けていたかもしれません。 OAV の利用は、大腸菌にとってエネルギーを消費する代謝経路である可能性があります (自然進化により現代の細胞で進化した経路として)。したがって、エボは省エネの成長を達成するために球形を好んだに違いありません。形態学的変化が、栄養変化に応じて効率的な成長を達成するために代謝を調節する最も簡単な方法であるならば、現代の細胞がサイズ制御のための分子機構を進化させたことは合理的であり、その結果、細胞の形状にも影響を及ぼします49。原始細胞と原始環境の性質は両方とも不明のままであるが、本研究は、脂肪酸小胞が豊富な原始環境で成長した球状原細胞の裏付けとなる実証を提供する。

大腸菌の桿体から球体への変化は、共通の変異を持たない多種多様な変異と関連しており(図7)、形態変化に対する複数の遺伝的戦略を示唆している。興味深いことに、観察された変異は、6 つの系統のうち 3 つにおいて、同じ遺伝子、cAMP 活性化グローバル転写制御因子 crp64,65 内に固定されていました。 crpの変異はグルコースを用いた他の進化実験でも報告されている66,67,68ため、大腸菌が炭素源を効率的に利用するにはcrpによる転写制御が重要である可能性がある。形態学的変化は、バランスの取れた成長適性を達成するために炭素代謝の変化と関連しているに違いありません。 crp は L32、L10、および L12 間で共通の変異標的でしたが、変異位置は異なりました (補足データ 4 および 5)。変異は遺伝子機能を乱す非同義の置換または欠失（補足データ 4 および 5）であったため、進化中の細胞形状の適応度の増加に関連した変化に利益をもたらすに違いありません。ほぼ同数の突然変異が 6 つの系統で発生しており、それらの間で同等の進化圧力が示されています。

6 つの Evo で検出されたゲノム変異が示されています。必須遺伝子はアスタリスクで示されています。細胞構造と細胞タンパク質の存在量に役割を果たした遺伝子は、それぞれ赤と青で強調表示されます。複数の系統で出現した変異遺伝子は太字で示されています。元の大腸菌細胞と進化した大腸菌細胞の細胞形状を下部に示します。

一般的な遺伝的戦略は、転写と翻訳に関与する遺伝子を標的とすることでした (図 7、青)。これは細胞タンパク質の存在量のトレードオフとよく一致していました。タンパク質生合成における突然変異の増加は、原始生活から現代生活への進化の過程で、翻訳機構や遺伝暗号などにおける無数の革新が起こったという仮説を裏付けた69。さらに、細胞の形状を変化させるための多様な戦略が注目されました。細胞壁の組織を乱す変異は、L31、L32、およびL12で発生しましたが、L9、L10、またはL11では発生しませんでした（図7、赤）。それぞれ、ペプチドグリカンの生合成 70,71、細胞形状の調節 72,73、および桿状形状の形成 74 に関与する遺伝子 mrdB、mrdA、および mreC は、おそらく細胞の形状を桿体から球体に直接変化させたと考えられます。細胞構造関連遺伝子は初期生命期には存在せず、最小ゲノムから除外される可能性があるため、進化の過程で優先的に標的とされたのは合理的です13。つまり、それらは原始細胞にとって必須ではありません。直接的および間接的な戦略は、成長の適応性と細胞の形状の進化のダイナミクスと形態学的レベルの両方で認識できることに注意してください。

本研究は、集中的に報告されている原始細胞のプレバイオティクスの実証に加え、原始環境の資源体制を模倣した実験室環境において、棒状の細菌細胞が球形に変化するという最初の実験的証拠を提供するものである。棒状の形状が進化した細胞壁やその他の細胞構造に起因するものである場合、棒状から球状への逆の変化は、現代の細胞で使用されている十分に確立された細胞構造の崩壊と考えることができます。適応度を高める細胞形状の変化の実験的進化は、ある程度まで形態学的退化と考えることができます。多種多様な突然変異は、原始生命の進化における遺伝的戦略が多種多様であることを示しています。将来の遺伝子再構成により、形態変化に関連した脂肪酸小胞への適応が合理的に解明される可能性があります。

形態は可塑的形質とみなされているため、原始的な環境で球形がどのくらいの期間維持されるのかは不明のままです。進化力学による理論的予測（図1）は、炭素源とは無関係に、進化の延長が成長速度とアスペクト比の両方の増加を引き起こすことを示しました（補足図12）。しかし、OAVで進化した細胞のアスペクト比は6系統間で大きなばらつきを示し、原始環境における球形の可塑性が高いことを示した。固定されたゲノム変異は球形性の安定性を示しているが、OAV の進化が長引くと、形態学的特徴を乱し、細胞の形状を変化させる新たな変異が生じる可能性がある。大腸菌を用いた今回の実験的実証は、原始細胞の形態学的決定の普遍性を表していない可能性がある。しかし、脂肪酸小胞に囲まれた現代の細菌により、棒状から球状への形態的退化が見られます。おそらく球体の物理的および熱力学的安定性のため、球状の原始細胞は数十年にわたって推測されてきました。本研究は、原始環境における球状細胞の成長上の利点について合理的な理解を提供し、プレバイオティクス研究と同様に、その発見はこの推測を強く裏付けています。卵形の原始細胞 (LUCA) と桿状の初期細菌 (LBCA) が最近報告されました 75。元の細胞の形状を完全に解明するには、合成細胞と遺伝物質を組み合わせた今後の研究が必要です。

以前に構築された遺伝子操作された実験室用大腸菌株 MDS42ΔgalK::Ptet-gfp-kan 54 を実験進化に使用しました。この株は、もともと野生型ゲノム MG1655 からトランスポゾンを除去して得られた、縮小ゲノム MDS42 を保有していました 16。

OAV 添加最小培地は、3 つの原液を ddH2O と混合することによって調製され、最終組成は 62 mM K2HPO4、39 mM KH2PO4、15 mM (NH4)2SO4、0.009 mM FeSO4、0.015 mM チアミン塩酸塩、0.2 mM MgSO4、および0.035 ～ 3.5 mM OAV。塩基溶液、微量元素溶液、および OAV 溶液は 3 つのストック溶液でした。３１０ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１９５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、７５ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、および０．０４５ｍＭのＦｅＳＯ４を含む基礎溶液を、２ＭのＫＯＨでｐＨ８．３に調整した。微量元素溶液は、15 mM チアミン塩酸塩および 203 mM MgSO4 を含みました。 5 mM オレイン酸小胞を含む OAV 溶液は、以前の報告 76 の方法に若干の変更を加えて調製しました。まず、予め脱気したオレイン酸（ニートオイル）316μLを、4mLに5M NaOH 190μLを加えて調製したアルカリ水（pH＞10）4.19mLに懸濁してミセル溶液を調製した。 ddH2Oの。懸濁溶液(250 mM オレイン酸ミセル)をボルテックスし、室温で一晩撹拌した。続いて、２５０ｍＭのオレイン酸ミセルを最終濃度５ｍＭに希釈し、ＨＣｌ（ＳｉｎｏｐｈａｒｍＣｈｅｍｉｃａｌＲｅａｇｅｎｔＣｏ．，Ｌｔｄ．、中国）でｐＨ８．３に調整することによって、ＯＡＶ溶液を調製した。培地はすべて、LE-200 押出機 (Morgec、中国) および 0.2 μm ヌクレオポアポリカーボネート膜 (Whatman、英国) で 3 回押し出し、次に 0.22 μm 膜 (Millipore、米国) を備えた 250 mL 濾過ユニットで滅菌しました。 62 mM K2HPO4、39 mM KH2PO4、15 mM (NH4)2SO4、0.009 mM FeSO4、0.015 mM チアミン塩酸塩、0.2 mM MgSO4 および 0.105 ～ 10.5 mM グルコースを含むグルコース添加最少培地を、前述のように調製しました 77。 OAV添加培地と同様に、培地を2M KOHで最終的にpH 8.3に調整した。培地調製に使用した化学試薬は、特に記載のない限り、Sigma-Aldrich (セントルイス、ミズーリ州、米国) から購入しました。

大腸菌株を最初に、ＣｙｃｌｅｒＳｅａｌシーリングフィルム（Ａｘｙｇｅｎ、米国）でシールされた平底９６マイクロウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、米国）中の３．５ｍＭＯＡＶを含む最小培地２００μＬに接種した。マイクロプレートをバイオシェーカー (MBR-022UP、Taitec、日本) 内で 200 rpm の回転速度で 37 °C でインキュベートしました。数回継代した細胞を、LB寒天プレート上に細胞培養物をプレーティングすることによって単一コロニーの単離に供した（補足図1A）。単一コロニーのうちの 1 つだけが実験進化のための Ori として選択されました。選択したコロニーを、3.5 mM OAVを含む最小培地3 mLに接種し、約108細胞/mLまで増殖させた。得られた細胞培養物はストックとして保存され、実験進化の共通の Ori として使用されました。抗毒素higAをコードするygiMにおけるTの一塩基挿入が、大腸菌株と比較してOriにおいて最初に検出されたことに留意されたい。

OAV (L#) またはグルコース (G#) のいずれかで進化した 6 つの独立した系統が、上記の Ori の普通株から生成されました。細胞を、3.5 mM OAV または 10.5 mM グルコースを含む 3 mL の最少培地で培養し、細胞培養物をバイオシェーカー (MBR-022UP、Taitec、日本) 中で 200 rpm の回転速度で 37 °C でインキュベートしました。新鮮な培地への毎日の連続移入は、3 つの異なる希釈率で実行されました (補足図 1A)。これは、以前に記載されているように、毎日の増殖率に従って推定されました 78。細胞増殖が対数期（例、約 107 細胞/mL）内にあった 3 つの培養物のうち 1 つだけを、次の連続移入に使用しました。遺伝的浮動を避けるために、毎日の移入の初期細胞濃度が 104 細胞/mL より高かったことに注意してください。 6 つの系統は相互汚染を避けるために独立して生成されました。毎日の細胞培養物はすべて、-80 °C で 15% グリセロールを保存しました。

大腸菌細胞集団は、INSPIRE 取得ソフトウェア (Luminex、米国) がインストールされた Amnis™ ImageStream™X イメージングフローサイトメーターを使用して分析されました。緑色蛍光は 200 mW 488 nm レーザーで誘導され、発光はチャンネル 2 の 505 ～ 560 nm フィルターで検出されました。明視野データはチャンネル 4 で収集され、側方散乱 (SSC) は 2 mW 785 で生成されました。 nm レーザーを使用し、発光は 745 ～ 800 nm フィルターを備えたチャネル 6 で収集されました。画像は、倍率 60 倍、ピクセルサイズ 0.09 μm2、低流量、高感度で取得されました。 SpeedBead キャリブレーション試薬 (400041、Luminex、米国) を内部ビーズとして毎日のキャリブレーションに使用し、リアルタイムの速度検出とオートフォーカスのために同時に実行しました。イメージングフローサイトメーターで測定するために、細胞培養物を新鮮な培地で 1 ～ 100 倍に希釈しました。 IDEAS ソフトウェア（v.6.2.183.0、Luminex、米国）を使用して、内部ビーズと細胞培養残骸を排除するために、蛍光強度と蛍光アスペクト比強度に従って約 10,000 個の細胞（データポイント）を取得およびゲートしました（補足図 1B）。）。

形態解析に使用される細胞（データポイント）は、前述のように、細胞画像の鮮明度の品質、つまり蛍光勾配RMS（画像鮮明度の二乗平均平方根）に従ってさらにゲートされました（補足図1B）。焦点が合った細胞画像のみを分析に使用しました。細胞の相対的な長さと幅は、それぞれ細胞画像の最も長い寸法と最も狭い寸法である長軸と短軸の長さによって表されました。細胞の形状は、短軸の長さを長軸の長さで割ったアスペクト比で表され、画像内の細胞の球形度を示しました。相対的な細胞サイズは、面積と体積という 2 つの特徴によって表されました。相対細胞面積 (A) は細胞画像の総ピクセルであり、相対細胞体積 (V) は細胞の相対長さ (L) と幅 (W) に従って次の式 (式 1) で計算されました。）、以前に報告されたように80。

大腸菌細胞をグリセロールストックから、3.5 mM OAV 添加または 10.5 mM グルコース添加最少培地 3 mL を含む試験管に接種し、バイオシェーカー (MBR-022UP、Taitec、日本) 中で 200 rpm および 37 ℃でインキュベートしました。前培養として °C。続いて、前培養物を、それぞれ 0.035、0.07、0.35、0.7、または 3.5 mM の OAV、または 0.105、0.21、1.05、2.1、または 10.5 mM のグルコースを共通の希釈率で供給した 3 mL の新鮮な最小培地に移しました。 1000倍。 10 試験管ごとに並行培養を各濃度に適用しました (合計 10 濃度)。細胞培養が定常期に達するまで、数時間間隔で細胞濃度、形態、蛍光などの変化をイメージングフローサイトメーターで評価しました。利用能力は、一時的な測定に従って計算された最大細胞濃度 (細胞/mL) の平均値 (N > 5) を、供給された炭素源、つまり OAV の濃度 (mM) で割った値として定義されました。またはブドウ糖。定常的な集団密度を測定し、mM 炭素源あたりの細胞濃度を集団容量として計算しました。結果は補足データ 6 にまとめられました。

大腸菌細胞をグリセロールストックから 3 mL の 10.5 mM グルコース添加最少培地を含む試験管に接種し、バイオシェーカー (MBR-022UP、Taitec、日本) 中で 200 rpm、37 °C で前培養としてインキュベートしました。前培養物を、0.105、0.21、1.05、2.1、または10.5 mMのグルコースを供給した新鮮な最少培地で1000倍に希釈し、その後、培養条件ごとに位置を変えて6つのウェル内の平底96ウェルマイクロプレート（Corning、USA）にロードしました。、前述したように77。マイクロプレートをプレートリーダー (Synergy H1、BioTek、米国) 内で 282 cpm、37 °C で連続的に軌道振盪しながらインキュベートしました。 600 nm での吸光度を測定することで増殖を監視し、30 分間隔で 20 ～ 30 時間測定値を取得しました。前述のように、増殖率は OD600 の変化に従って計算されました 81。

大腸菌細胞を 2.5% グルタルアルデヒドで固定し、続いて 1% OsO4 で 4 °C で 1 時間処理しました。次に細胞を PBS (リン酸緩衝生理食塩水) で 3 回リンスし、段階的シリーズ (30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%) のエタノールで脱水し、臨界水で乾燥させました。ポイントドライヤー（Leica EM CPD 300、Leica Microsystems GmbH、Wetzlar、ドイツ）で処理し、スパッターコーター（ACE600、Leica Microsystems）で金でコーティングしました。調製したサンプルを走査型電子顕微鏡（日立 S-4800、日本）を使用して加速電圧 3 kV で観察しました。

グルコースを添加した最少培地で増殖させた大腸菌細胞は、以前に記載されているように、ゲノム変異分析のために定常期に回収されました63。ゲノム再配列決定は Sangon (中国、上海) によって行われました。ゲノム DNA は、Magen Bacterial DNA KF Kit (Sangon、上海、中国) によって抽出され、gDNA ライブラリーは、NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina (NEB、USA) を使用して構築されました。全ゲノム再配列決定は、NovaSeq 6000 (Illumina、カリフォルニア州サンディエゴ) および MGISEQ-2000 プラットフォーム (MGI、中国深セン) を使用して、メーカーの指示に従って実行されました。リードは参照配列 (NCBI アクセッション番号 NC_020518.1) にマッピングされ、ゲノム変異、つまり SNP とインデルがゲノム解析ツールキット (GATK) で決定されました。 RAW データセットは、アクセッション番号 PRJNA693085 (SRR13487015-SRR13487022) で BioProject に寄託されました。

すべての生物学的実験は繰り返し実行されました (N = 5 ～ 12)。結論を引き出すために、すべての分析に対して統計的評価 (N > 4) が行われました。詳細は、実験と分析の対応するセクションで説明されています。繰り返しの実験から取得され、統計分析に使用されたデータセットは、参考のために補足データとして提供されます。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

ゲノム配列データは、アクセッション番号 PRJNA693085 で BioProject に寄託されています。分析と数値の生成に使用されるソースデータは、補足データ 1 ～ 6 で入手できます。その他のデータは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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著者らは、電子顕微鏡写真の作成にご協力いただいた ECNU イノベーション多機能プラットフォーム (004) 電子顕微鏡センターの Yiwen Wang 氏と Zhiwei Gong 氏に感謝します。本研究は、中国国家重点研究開発計画「合成生物学研究（2019YFA0904500）」および環境省ECNUの信頼できるソフトウェア国際共同研究室の支援を受け、また、一部はJSPS科研費科学研究費補助金（B）の支援を受けました。許可番号 19H03215 (BWY 宛)。

生物医学合成生物学研究センター、華東師範大学生命科学部、3663 North Zhongshan Road、Shanghai、200062、PR China

Hui Lu、Yang Xia、Jian Xu、Kai Li、四方哲也

〒305-8572 茨城県つくば市天王台 1-1-1 筑波大学大学院生命環境科学研究科

Honoka Aida, Masaomi Kurokawa & Bei-Wen Ying

華東師範大学ソフトウェア工学部、3663 North Zhongshan Road、Shanghai、200062、PR China

フェン・チェン

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BWY と TY がこの研究を発案しました。 BWY は実験を設計しました。 HL が実験を実施しました。 HL、MK、HA、BWY がデータを分析しました。 MK、YX、CF、JX、および LK は実験および分析ツールを提供しました。 BWY は論文とグラフィックの草稿を作成しました。 HL、JX、BWY、TY が論文を改訂しました。そして著者全員がその論文を承認した。

Bei-Wen Ying または四方哲也への通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた Nkrumah Grant と他の匿名の査読者に感謝します。主な編集者: Thulani Makhalanyane と Caitlin Karniski。査読者レポートが利用可能です。

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転載と許可

陸宏、相田洋、黒川正他原始模倣は大腸菌の形態変化を誘発します。 Commun Biol 5、24 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s42003-021-02954-w

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受信日: 2021 年 2 月 15 日

受理日: 2021 年 12 月 7 日

公開日: 2022 年 1 月 11 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-021-02954-w

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