ウイルス膜融合を促進できる小分子の同定 | 南寧ピーコックプライド株式会社

Virology Journal volume 20、記事番号: 99 (2023) この記事を引用

359 アクセス

2 オルトメトリック

メトリクスの詳細

高病原性ウイルスの侵入を分析するために、いくつかのアプローチが開発されています。この研究では、顕微鏡ベースの機器を必要とせずに、SARS-CoV-2 S媒介膜融合を安全かつ効率的にモニタリングするための二分子多細胞相補（BiMuC）アッセイの実装について報告します。 BiMuC を使用して、承認された医薬品のライブラリーをスクリーニングし、S タンパク質媒介の細胞間膜融合を促進する化合物を同定しました。そのうち、エチニルエストラジオールは、in vitro で SARS-CoV-2 およびインフルエンザ A ウイルスの増殖を促進します。私たちの発見は、SARS-CoV-2を含むエンベロープウイルスのライフサイクルを調節する小分子を同定するBiMuCの可能性を示しています。

新しい重症急性呼吸器症候群コロナウイルス-2 (SARS-CoV-2) [1、2] は、コロナウイルス病 2019 (COVID-19) として知られるパンデミック疾患を引き起こしました。この病気は、私たちの医療システムと世界経済に多大な影響を与えてきましたし、これからも与え続けます。したがって、新型コロナウイルス感染症に関連する罹患率と死亡率を減らすための予防および治療手段を開発するために、並外れた努力が払われてきました。

細胞膜は、ウイルスが新しい細胞に感染するときに最初に遭遇する障壁です。エンベロープを持ったウイルスは侵入中のある時点で細胞膜とウイルス膜を融合する必要があります。 SARS-CoV-2 の場合、高度にグリコシル化されたスパイク (S) タンパク質が宿主細胞への侵入を担っています [3]。クラス I 三量体融合タンパク質 [4] である S タンパク質は、非活性型 (S0) で翻訳されます。宿主プロテアーゼ (すなわち、TMPRSS2) による S0 のタンパク質分解活性化により、ビリオンに組み込まれた成熟融合前 S タンパク質が生成されます [5]。感染プロセスは、細胞表面のアンジオテンシン変換酵素 2 (ACE2) への S タンパク質の結合から始まります [2、6]。 ACE2 への結合は構造変化を引き起こし、その結果 S タンパク質融合ペプチドが露出し、宿主膜と相互作用してウイルス膜と細胞膜の融合が開始されます。この複雑なプロセスの複数のステップのいずれかを促進すると、ウイルス生産が高速化および増加し、従来のワクチン開発が促進され、生産コストが削減され、製造収率が増加します[7]。

ウイルス侵入を安全に分析するために、疑似型ウイルスベースのアッセイ、ウイルス様粒子ベースのアッセイ、生化学的アッセイ、または細胞細胞融合アッセイなど、複数のアプローチが開発されています。シンシチウムの同定は、細胞表面上のウイルス融合機構および対応する宿主受容体の発現のため、伝統的に顕微鏡検査によって行われてきました。しかし、顕微鏡ベースの方法論は、融合プロセスの定量化と小分子同定のための高スループット法の実装を妨げます。

SARS-CoV-2 S 媒介膜融合プロセスを研究するために、私たちは最近開発された二分子多細胞相補 (BiMuC) アッセイを採用することにしました [8]。蛍光レポータータンパク質の二分子相補特性に基づいて、このアッセイは、顕微鏡ベースの装置の助けを借りずに、ウイルス誘発性の細胞間融合イベントの同定と定量化を容易にします。 BiMuC を SARS-CoV-2 の研究に適応させた後、S タンパク質媒介膜融合プロセスを調節できる小分子のスクリーニングをセットアップしました。このアッセイを使用して 1,280 個の小分子をスクリーニングし、エチニルエストラジオールが S タンパク質媒介の細胞間膜融合を促進することを確認しました。結果として、エチニルエストラジオールは、in vitro で SARS-CoV-2 の増殖を増強します。さらに、ウイルス媒介膜融合に対する影響は SARS-CoV-2 に限定されません。我々は、エチニルエストラジオールがA型インフルエンザウイルスの増殖とニパウイルスの膜融合を増加させる可能性があることを実証しました。私たちの結果は、BiMuC を実装して SARS-CoV-2 膜融合プロセスを監視し、このプロセスを乱す小分子を特定できることを示しています。

Hek 293T、Vero E6、および Madin-Darby 犬腎臓 (MDCK) 細胞は ATCC (http://www.atcc.org) から入手し、ダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM) (Gibco、http://www) で維持しました。 .lifetechnologies.com) には 10% ウシ胎児血清 (FBS、Gibco) が添加されています。 SARS-CoV-2 S プラスミドは、F. クラマー博士 (マウントサイナイのイチャン医学校) から寄贈されました。 Jun-Nt VFP (Jun) および Fos-Ct VFP (Fos)、ならびにヒト ACE2 および TMPRSS2 発現プラスミドは、Addgene から入手しました (それぞれ #22,012、#22,013、#1786、および #53,887)。

SARS-CoV-2 の膜融合特性を研究するために、Hek 293T 細胞 (10% FBS を添加した DMEM) をポリエチレンイミン (PEI) [9]、SARS-CoV-2 S および Jun、または ACE2 および Fos とpRL Renilla Luciferase (Promega) を使用してシグナルを正規化します。さらに、SARS-CoV-2 S-Fos と ACE2-Jun の組み合わせを pRL ウミシイタケルシフェラーゼで再度テストしました。翌日、細胞を計数し、混合し、96 ウェルプレートに播種しました (100 μL の培地中 1 × 105 細胞/ウェル)。 48時間後、以前に記載されているように[10]、96ウェルプレート上で蛍光を測定しました(λexc = 485 nm、λem = 535 nm)。

膜融合を調節する能力を持つ小分子を同定するために、必要なスクリーニング標準を満たすようにプロトコルが調整されました。アッセイの堅牢性を評価するために、Z' 因子と信号対雑音 (S/N) 比を計算しました。 Z'-factor = 1 − ((3δpos + 3δneg)/(µpos − µneg))、ここで、µpos はポジティブコントロールの平均シグナル、µneg はネガティブコントロールの平均シグナル、δpos はポジティブコントロールの標準偏差です。 δneg はネガティブコントロールの標準偏差です。簡単に説明すると、10% FBS を添加した DMEM を使用して、Hek 293T 細胞を 15 cm ディッシュ (5 × 106 細胞/ディッシュ) に播種しました。 24 時間のインキュベーション (37 °C、5% CO2) 後、上記の組み合わせまたはモックトランスフェクトでプラスミドを含む PEI を使用して細胞をトランスフェクトしました。翌日、細胞を計数し、混合し、黒色の 96 ウェルプレートに手動で播種しました (100 μL の培地中 1 × 105 細胞/ウェル)。細胞を2つのプールに混合し、プールAにはJunおよびSARS-CoV-2 SまたはFosおよびACE2を発現する細胞が含まれ、プールBにはJunまたはFosを発現する細胞が含まれました。カラム 1 ～ 11 のウェルにはプール A からの 50 μL の細胞を播種し、カラム 12 にはプール B からの 50 μL の細胞を播種しました。次に、50 μM の低分子化合物 50 μL を手動で細胞に添加しました (最終濃度 25 μM) 、０．２５％ＤＭＳＯ）。 96 ウェルプレートに 1,280 の化合物を含む Prestwick Chemical ライブラリ (Sigma、セントルイス、ミズーリ州、米国) を使用しました。カラム 1 および 12 (それぞれ、陽性および陰性対照) を各プレートで DMSO で処理しました。 48 時間のインキュベーション後、培地を 100 μL の PBS に置き換え、VictorX マルチプレートリーダー (Perking Elmer、米国マサチューセッツ州ウォルサム) で蛍光を測定しました。スクリーニングから得られた結果は、次のように計算された Z スコアを使用して標準化されました: Z スコア = (x − μ)/δ、ここで、x は生の信号、μ は平均信号、δ はすべての信号の標準偏差です。 1 つのプレートの化合物を含むウェル。 Z スコアは、特定の化合物がプレートの平均よりどれだけ標準偏差上または下であるかを示します。各化合物の Z スコアを計算し、ヒット選択基準を適用することで、一次ヒットを特定しました。 Z スコア > 1.5。二次審査でヒットが確認されました。今回の細胞にはpRL-Renillaが含まれていました。発光は、Ｓｉｇｍａのウミシイタケルシフェラーゼアッセイキットを使用し、９６ウェル白色細胞培養プレート上で製造業者のプロトコールに従って測定した。この手段により、細胞分裂や生存を促進する化合物の除去が促進され、細胞間融合を効果的に増加させることなく蛍光シグナルが増加します。ＶＦＰと同様の蛍光特性を有するヒットを廃棄するために、細胞を黒色の９６ウェルプレートに播種し、上記と同じ条件下で化合物で処理した。この場合、蛍光は以前と同様に測定されました (λexc = 485 nm、λem = 535 nm)。すべてのアッセイにおいて、[DMSO] は 1% 以下に維持されました。統計分析は Libre Office Calc を使用して行われました。

ニパウイルスによって誘発される膜融合に対する影響を研究するために、[8] に記載されている独自の BiMuC アッセイを実行しました。この場合、Hek 293T 細胞を Jun-Nt、NiV F、G または Fos-Ct とウミシイタケルシフェラーゼをコードするプラスミド (pRL、Promega) でトランスフェクトしました。次に、細胞プールを混合し、示された化合物で処理しました (DMSO 濃度は 1% に維持しました)。 48時間後、蛍光を測定した。少なくとも 3 つの独立した実験が行われました。

化合物の毒性は、製造業者の指示に従い、Cell-Titer Glo (Promega) を用いて評価した。簡単に説明すると、細胞を不透明な白色の 96 ウェルプレートに播種し (約 1 × 104 細胞/プレート)、指定された濃度の適切な化合物で 48 時間処理しました。次に、100 μl の CellTiter-Glo® 試薬を添加し、発光シグナルを 10 分間安定させました。発光は、VictorX マルチプレートリーダー (Perking Elmer、米国マサチューセッツ州ウォルサム) で記録されました。

Vero E6 細胞は、感染多重度 (MOI) 0.01 で SARS-CoV-2 に感染しました。次に、エタベリン、ラベプラゾール、またはエチニルエストラジオールを適切な濃度で添加しました。さらに、細胞をDMSOで処理しました。 48時間後、上清を収集し、VeroE6細胞における標準的なプラークアッセイによって力価を測定した。あるいは、MDCK細胞をMOI 0.001でIAV/WSN/33に感染させた。サンプルを、エタベリン、ラベプラゾール、またはエチニルエストラジオールの非存在下または存在下で、指定された濃度で 48 時間インキュベートしました。次に、上清を収集し、MDCK 細胞における 50% 組織培養感染量 (TCID50) 法によって力価測定しました。すべてのアッセイにおいて、[DMSO] は 1% 以下に維持されました。

BiMuC による SARS-CoV-2 膜融合の解析。 BiMuC アッセイの概略図。 Jun タンパク質と Fos タンパク質をそれぞれ VFP の Nt 末端と Ct 末端に融合させて、VN-Jun キメラと VC-Fos キメラを作成しました。以後、単に Jun と Fos と表記します。 VFP の構造 (緑色で表示) の再構成、つまりその蛍光特性は、Jun と Fos の相互作用後にのみ発生します。 VN-Jun キメラと VC-Fos キメラが別々の細胞プールで発現される場合、再構成は不可能です (左)。 SARS-CoV-2 膜融合は、SARS-CoV-2 S とヒト ACE2 間の相互作用の成功に依存しています。これら 2 つのタンパク質を 2 つの隣接する細胞の表面で発現させると、細胞膜が融合し、合胞体が形成されます (中央)。融合される細胞が VN-Jun および VC-Fos を保持している場合、キメラは VFP 本来の構造を再構成できます (緑色、左)。逆に、Sタンパク質の合成と成熟からACE2との相互作用まで、膜融合につながる細胞またはウイルスのプロセスを阻害すると、蛍光シグナルが消失します。 B 細胞間融合アッセイでは、Hek 293T 細胞を指定のプラスミドの組み合わせでトランスフェクトしました。つまり: Jun + SARS-CoV-2 S、Fos + hACE2、Jun + hACE2、Fos + SARS-CoV-2 S、Jun + Fos、Jun、Fos、SARS-CoV-2 S、hACE2、Fos + hACE2 + TMPRSS2。翌日、各細胞プール内の細胞を計数し、示されているように混合した。 48時間後、蛍光を測定した。少なくとも 3 回の独立した実験の平均と標準偏差が表示されます (n 値はそれぞれ 7、6、6、6、3、3)。実線のドットは、各実験の個別の値を表します。緑色のバーは、陽性対照 (Jun-Fos) と同等の蛍光レベルを持つサンプルを示します。統計的差異は両側均一分散 t 検定に基づいています (p 値は対応するバーの上に示されており、ns は有意ではありません)。

新型 SARS-CoV-2 は非常に感染力の強い病原体です。したがって、その取り扱いには十分な安全対策が必要であり、研究プロトコルが複雑になる可能性があります。 SARS-CoV-2 S 媒介膜融合プロセスの研究を促進するために、蛍光ベースの相補アッセイを実施することにしました [8]。 BiMuC アプローチは、Venus 蛍光タンパク質 (VFP) などのいくつかの蛍光タンパク質の構造特性に基づいた、安全でウイルスのないアプローチです [10、11、12、13]。簡単に言うと、VFP は 2 つのフラグメント (それぞれ VN と VC) に分割でき、いずれもそれ自体では蛍光を発しません。しかし、これら 2 つのフラグメントが、それらを結び付ける相互作用する一対のタンパク質に融合すると、VFP の本来の構造が再構成され、その蛍光特性が回復します。キメラは、膜融合に必要なウイルス機構とともに、分離された細胞プール内で発現されます。膜融合によって蛍光キメラが近くに来ると、蛍光が再構成されます。逆に、シンシチウム形成条件が満たされない場合にはシグナルは得られません（図1A）。

低分子の同定。膜融合促進特性を備えた小分子の同定に使用される BiMuC アッセイの概略図。 B 低分子スクリーニングのワークフロー表現と結果として得られるヒットの検証

この方法論を SARS-CoV-2 誘発膜融合の研究に適用できるかどうかをテストするために、相互作用パートナーである c-Jun および c-Fos [14] を VFP の VN および VC フラグメントに連結し、c -Jun/VN および c-Fos/VC キメラ。今後は単に Jun と Fos として表示されます。これらのキメラは、それぞれ SARS-CoV-2 S (Jun-S) と ACE2 (Fos-ACE2) を含む 2 つの独立した細胞プールで発現されました。さらに、Jun と Fos を一緒にトランスフェクトした細胞 (Jun-Fos)、Jun、Fos、S、ACE2、または空のプラスミド (Empty) をアッセイに含めました。トランスフェクション後、細胞プールを指示どおりに組み合わせ、さらに 48 時間インキュベートしました (図 1B)。 Jun-S および Fos-ACE2 でトランスフェクトされた細胞を含むサンプルは、Jun と Fos または S と ACE2 を発現する細胞のプール (陰性対照) を組み合わせたものよりも有意に強い蛍光シグナルを示し、これは細胞膜の融合が成功したことを示唆しています。ウイルス機構は 2 つのキメラを結合させ、蛍光シグナルの再構成を促進しました (図 1B)。 Jun-ACE2 と Fos-S の組み合わせもテストしたことに注意してください。私たちのデータは、BiMuC 方法論が SARS-CoV-2 媒介膜融合を安全に研究するために実装できることを示唆しています。 SARS-CoV-2 S 誘発性合胞体の画像は補足図 1 にあります。

ウイルスのライフサイクルに影響を与える小分子を特定するには、多くの場合、スケーラブルで堅牢なハイスループットスクリーニング (HTS) プロトコルが必要です。これらの手順は、SARS-CoV-2 などの高病原性ウイルスの場合にも安全である必要があります。 SARS-CoV-2 BiMuC アッセイがハイスループット条件で使用できることを実証するために、SARS-CoV-2 S 媒介膜融合プロセスに影響を与える小分子を同定するアッセイをセットアップしました。私たちは、ウイルスの侵入を促進する可能性のある小分子に特に興味を持っていました。新しいワクチンプラットフォームを導入しているにもかかわらず、ワクチン生産は多くの場合、大量のウイルスの生産に依存しています。したがって、細胞の選択から複製手順の最適化まで、ウイルス産生を増加させるためにさまざまな戦略が実施されてきました[15、16、17]。ウイルスと膜の融合を促進できる分子は、理論的にはウイルスの増殖を促進し、従来のワクチン生産を促進するために使用できる可能性がある[7]。

私たちのアッセイは、低レベルの ACE2 および TMPRSS2 を発現する Hek 293T 細胞に基づいています [18、19]。 ACE2はトランスで補充されましたが、シンシチウム形成を促進する小分子の同定を容易にする次善の融合状態を設定するために、意図的にTMPRSS2をアッセイに含めませんでした。ウイルス生産を加速または増加させると、ワクチン開発が促進され、生産コストが削減され、製造収率が増加します[20]。私たちのアッセイがウイルス融合の増加を特定できることを確認するために、ACE2 とのトランスフェクションミックスに TMPRSS2 を含めました (Fos-ACE2-TMPRSS2)。予想どおり、このセリンプロテアーゼを添加すると、観察される蛍光シグナルが増加しました (図 1B)。これらの結果は、私たちのセットアップがウイルスと細胞の膜融合を促進する化合物を同定できることを裏付けています。

次に、我々の方法論を小分子の HTS に適用し、Z' 係数 (Jun-S + Fos-ACE2 または Jun-ACE2 + Fos-S の組み合わせでそれぞれ 0.63 または 0.62) によってその適合性を検証しました [21]。簡単に説明すると、Hek 293T 細胞に Jun-S または Fos-ACE2 と、構成的プロモーター下でウミシイタケルシフェラーゼをコードするプラスミドをトランスフェクトしました。トランスフェクション後、細胞プールを上記のように混合し、96 ウェルプレートに播種し、適切な小分子で処理しました。各プレートには、DMSOで処理されたウェルの列が含まれていました。さらに、プレートには、Jun または Fos でトランスフェクトされ (両方の細胞プールは前述のように結合されました)、DMSO で処理された細胞を含むネガティブコントロールとして 8 ウェルが含まれていました。処理後、細胞を 48 時間インキュベートし、続いて蛍光測定とヒット選択を行いました (図 2A)。

ヒット化合物の分析。 A-F 選択した化合物を再購入し、シンシチウム形成を増加させる能力を BiMuC アッセイでテストしました。簡単に説明すると、Hek293T 細胞に Jun と SARS-CoV 2 S タンパク質をトランスフェクトし、独立して Fos およびヒト ACE2 をトランスフェクトしました。 24 時間後、サンプルを合わせて、指定された濃度の適切な化合物で処理するか、48 時間模擬処理しました。次に、融合のパーセンテージを示す蛍光を計算しました。模擬（DMSO）処理サンプルに対する蛍光パーセンテージが表示されます。少なくとも 3 回の独立した実験の平均と標準偏差が表示されます。点は個々の実験を表します。片側等分散性 t 検定に基づいて、化合物サンプルと模擬処理サンプル間の統計的差異を計算しました。有意差が見つかった場合は p 値が表示されます

1,280 の化学的に多様な小分子 (Prestwick Chemical、GreenPharma) からなるライブラリーがスクリーニングされ、結果は Z スコアによって標準化されました。 76 個のプライマリヒットが、Z スコア > 1.5 に基づいて選択されました (表 S1)。同じ実験条件と選択基準を使用してヒットを再テストしました。両方のラウンドでウイルス融合を促進できる化合物のみを考慮しました (図 2B)。さらに、ウミシイタケルシフェラーゼからの発光を測定し、細胞分裂や生存を促進する化合物を除去することで、細胞間融合を効果的に増加させることなく蛍光シグナルを増加させました。また、残りのヒットの蛍光特性もテストし、530 nm 付近で発光する化合物を廃棄しました (図 2B)。

合計 6 つの化合物が選択されました。これらを別のベンダーから購入し、Hek 293T におけるウイルス膜融合を増強する能力を確認するために複数の濃度で再試験しました。化合物を 48 時間または 72 時間インキュベートしました (図 3 および 4)。化合物を 48 時間インキュベートした場合、ウイルス誘導性の膜融合がわずかに増加することが観察されました。ラタノプロスト、シンバスタチン、およびエチニルエストラジオールは、より強力な誘導剤でした。ただし、72 時間のインキュベーション後、ほとんどの化合物 (ディペロドンを除く) は蛍光シグナルを増強します。化合物を 48 時間インキュベートした場合、限られた用量反応が観察されました。しかし、より強い用量依存性が治療後 72 時間で観察されました。

72 時間のインキュベーション後のヒット化合物の分析。 A-F 選択した化合物のシンシチウム形成を増加させる能力を、Hek293T 細胞における BiMuC アッセイでテストしました。簡単に説明すると、Hek293T 細胞に Jun と SARS-CoV 2 S タンパク質をトランスフェクトし、独立して Fos およびヒト ACE2 をトランスフェクトしました。 24 時間後、サンプルを合わせて、指定された濃度の適切な化合物で処理するか、72 時間模擬処理しました。模擬（DMSO）処理サンプルに対する蛍光パーセンテージが表示されます。少なくとも 3 回の独立した実験の平均と標準偏差が表示されます。点は個々の実験を表します。片側等分散性 t 検定に基づいて、化合物サンプルと模擬処理サンプル間の統計的差異を計算しました。差が有意な場合は、p 値が表示されます

TMPRSS2 存在下でのヒット化合物の分析。 A-F 選択した化合物が TMPRSS2 の存在下でシンシチウム形成を増加させる能力を BiMuC アッセイでテストしました。 Hek293T 細胞には、シンシチウム形成に必要なウイルスおよび細胞機構とともに TMPRSS2 をトランスフェクトしました。次に、細胞を混合し、適切な化合物で 48 時間処理しました。模擬（DMSO）処理サンプルに対する蛍光パーセンテージが表示されます。少なくとも 3 回の独立した実験の平均と標準偏差が表示されます。点は個々の実験を表します。片側等分散性 t 検定に基づいて、化合物サンプルと模擬処理サンプル間の統計的差異を計算しました。差が有意な場合は、p 値が表示されます

次に、選択した化合物が最適な増殖条件下でウイルス融合の増加を誘導できるかどうかを確認するために、48 時間のインキュベーション後に TMPRSS2 の存在下でそれらをテストしました。この場合、化合物の増強効果は、プロテアーゼを使用しない場合よりも実質的に強かった（図５）。注目すべきことに、プロテアーゼを添加すると、濃度依存的な応答が観察されました。

また、細胞内の ATP 含有量を測定することにより、これら 6 つの化合物の毒性を分析しました (図 6)。 Hek 293T 細胞では、6 つの化合物すべてが高濃度である程度の毒性を示しました。興味深いことに、これらの濃度での毒性にもかかわらず、細胞間融合の増加が観察されました。この濃度での CC50 および細胞間融合活性を表 1 に示します。左の列は活性指数 (細胞間融合の割合を CC50 で割ったもの) を強調表示しています。さらに、エチニルエストラジオールの毒性をTMPRSS2の存在下でテストしました（図S2）。結果は、化合物の毒性が細胞プロテアーゼの存在によって影響を受けなかったことを示しています。我々はまた、ワクチン目的でインビトロでウイルスを増殖させるために広く利用されている細胞株であるベロ細胞におけるこれらの化合物の毒性を分析した[15](図6)。この細胞株では、シンバスタチン (CC50 ~ 6 μM) が他の化合物よりも明らかに毒性を示しました。これらの結果（有効性と毒性）に基づいて、今後はエタベリン、ラベプラゾール、エチニルエストラジオールに焦点を当てることにしました。

ヒット化合物の毒性。 A、B Hek 293T 細胞および Vero E6 細胞 (それぞれ A および B) における毒性を、化合物を指定の濃度で 48 時間インキュベートした後に分析しました。毒性は、製造業者の指示に従ってCell-Titer Gloアッセイ(Promega)を使用してATPレベルを測定することによって分析した。点は、少なくとも 3 回の独立した実験の平均を表します。 C CC10、CC50、および CC90 の値は、パネル A および B に示されているデータを使用して計算されました。

エンベロープウイルスの侵入における選択した化合物（エチニルエストラジオール、エタベリン、ラベプラゾール）の役割をさらに分析するために、我々はニパウイルス（NiV）に注目しました。パラミクソウイルス科のメンバーである NiV は、ウイルス膜と細胞膜の融合を実行するために 2 つのタンパク質、受容体細胞の表面で受容体タンパク質に結合する糖タンパク質 (G) と、受容体細胞の表面で受容体タンパク質に結合する融合タンパク質 (F) を必要とします。次に、細胞膜とウイルス膜の融合が強制されます。 NiV は BSL4 制限付きエージェントです。したがって、エチニルエストラジオール、エタベリン、およびラベプラゾールの効果をテストするために、NiV 侵入の研究に適合した BiMuC アッセイを利用しました [8]。我々の結果は、これら 3 つの化合物すべてが穏やかな用量依存的な様式でウイルス媒介膜融合を増強できることを再度示しています (図 7)。

ニパウイルス膜融合に対するエチニルエストラジオール、エタベリン、およびラベプラゾールの影響。 NiV 膜融合に対するエチニルエストラジオール、エタベリン、およびラベプラゾールの効果を試験するために、Hek 293T 細胞に NiV F、G、および Jun をコードするプラスミドまたは Fos をトランスフェクトしました。約 24 時間後、細胞プールを混合し、適切な化合物を指定の濃度で添加しました。 48時間後、蛍光を測定した。棒は、少なくとも 3 回の独立した実験の平均と標準偏差を示します。データは、模擬処理されたサンプルを折り重ねて表示されます。フォス）。片側等分散性 t 検定 (p 値は対応するバーの上に示され、ns は有意ではない) に基づいて、化合物と模擬処理サンプル間の統計的差異を計算しました。差が有意な場合は、p 値が示されました

私たちのアッセイは合胞体形成に基づいており、感染時のウイルス膜と細胞膜の融合を正確に再現していない可能性があります。したがって、この時点で、SARS-CoV-2 のウイルス増殖に対するヒット化合物の影響を分析することにしました [18、22、23]。我々の結果は、ラベプラゾールとエチニルエストラジオールは、CC50未満の濃度で感染後48時間でウイルス力価を増加させることを示しましたが（図8A）、処理サンプルと未処理サンプルの間に有意差は見つかりませんでした。一方、エタベリンはSARS-CoV-2の増殖を増加させたり加速させたりしませんでした（図8A）。

SARS-CoV-2 および IAV に対する選択した化合物の効果。 SARS-CoV-2は、示された濃度のエタベリン、ラベプラゾール、またはエチニルエストラジオールの非存在下または存在下で、Vero E6細胞において0.01の感染多重度（MOI）で48時間増殖させた。次に、上清を収集し、Vero E6 細胞における標準的なプラークアッセイによって力価を測定しました。棒グラフは、少なくとも 3 回の独立した実験の平均プラーク形成単位 (pfu) と標準偏差を示します。点は個々の実験を表します。両側等分散性 t 検定に基づくと、処理サンプルと模擬処理サンプルの間に統計的な差異は見つかりませんでした。 B IAV/WSN/33 を 0.001 の MOI で使用して、Madin-Darby 犬腎臓 (MDCK) 細胞を感染させました。 IAV を、エタベリン、ラベプラゾール、またはエチニルエストラジオールの非存在下または存在下で、指定の濃度で 48 時間インキュベートしました。次に、上清を収集し、MDCK 細胞における 50% 組織培養感染量 (TCID50) 法によって力価測定しました。棒グラフは、少なくとも 3 回の独立した実験の平均プラーク形成単位 (pfu) と標準偏差を示します。点は個々の実験を表します。両側等分散性 t 検定に基づくと、処理サンプルと模擬処理サンプルの間に統計的な差異は見つかりませんでした。

次に、これらの化合物のウイルス増殖を促進する能力が SARS-CoV-2 に限定されるかどうかを分析しました。そのために、A 型インフルエンザウイルス (IAV) の増殖に対するエタベリン、ラベプラゾール、およびエチニルエストラジオールの影響をテストしました。 IAV は、季節性の伝染病の発生により、毎年かなりの罹患率と死亡率を引き起こします。季節性インフルエンザの流行はワクチン接種によって管理できる可能性があり、IAV およびインフルエンザ B ウイルス成分を含む多価ワクチンが毎年広く配布されています。 SARS-CoV-2 と同様、IAV は、ウイルス膜と細胞膜の融合をクラス I 融合タンパク質であるヘマグルチニン (HA) タンパク質に依存するエンベロープウイルスです。

選択した化合物の存在下および非存在下で、Madin-Darby イヌ腎臓 (MDCK) 細胞で IAV 感染を実施しました [24]。我々の結果は、有意差は見つからなかったが、エチニルエストラジオールがIAV力価を約1 log増加させることを示した(図8B)。一方、エタベリンとラベプラゾールはウイルス力価を増加させませんでした（図8B）。

私たちのスクリーニングで使用される化学ライブラリに含まれる化合物のほとんどは承認された薬剤であり、現在いくつかの治療法で使用されています。しかし、我々の実験は、エチニルエストラジオールを含むヒット化合物がエンベロープウイルス感染時の患者の転帰を悪化させる可能性があると主張するには不十分であることに注意することが重要です。

要約すると、我々の結果は、エチニルエストラジオールをインビトロでエンベロープウイルスの増殖を促進するために使用できることを示唆しています。以前の研究[25、26、27、28、29]に基づいて、エチニルエストラジオールはウイルスおよび細胞膜の特性を変化させ、膜融合および/またはウイルスのエンドサイトーシスを促進する可能性があります。ポリブレンなどの化合物は、正に帯電したポリカチオンの添加により細胞とウイルスの間の反発力が減少し、形質導入効率が向上するため、細胞表面へのビリオンの接着を促進することによってレトロウイルス感染を改善するために使用されます[30]。しかし、私たちが知る限り、膜融合を改善し、その後ウイルスの増殖を増加および加速する化合物はこれまでに同定されていません。

私たちの結果は、BiMuC を実装して SARS-CoV-2 膜融合プロセスを監視できることを示しています。さらに、この方法が、一部のエンベロープウイルスのウイルス侵入、ひいてはウイルスの増殖に影響を与える小分子のハイスループット同定に適していることを示します。

すべての研究データは論文および/または補足情報に含まれています。

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素晴らしい技術支援をしていただいた P. Selvi に感謝いたします。

この研究は、バレンシアナ中央政府 (PROMETEO/2019/065) によってサポートされ、MCIN/AEI/10.13039/501100011033 によって PID2020-119111GB-I00 が付与されました。 OZ は、MCIN/AEI/10.13039/501100011033 による助成金 PID2020-114546RB によって資金提供されています。 LG はバレンシアナ大学から博士課程前契約 (CIACIF/2021/119) を締結しています。 MR-S は、スペイン科学イノベーション省から博士課程前契約を締結しています (MCIN/AEI/10.13039/501100011033 による PRE2021-101042)。この出版物は、助成契約 871029 に基づいて欧州連合の Horizon 2020 研究およびイノベーションプログラムから資金提供を受けた European Virus Archive GLOBAL (EVA-GLOBAL) プロジェクトによっても支援されました。

バレンシア大学、ブルジャソ、E-46100、スペイン、大学生物工学・生物医学研究所（BIOTECMED）生化学・分子生物学部

ヘスス・ガルシア＝ムリア、ラウラ・ガデア＝サロム、マリーナ・リウス＝サルバドール、イスマエル・ミンガロ、ルイス・マルティネス＝ギル

動物衛生研究センター、CISA (国立農業食品研究技術研究所/Consejo Superior de Investigaciones Centíficas (INIA/CSIC))、マドリード、スペイン

サンドラ・モレノ & アレハンドロ・ブラン

菌学参照研究所、国立微生物学センター、Instituto de Salud Carlos III、マハダオンダ、マドリード、スペイン

オスカー・サラゴサ

感染症ネットワーク生物医学研究センター (CIBERINFEC、カルロス 3 世保健研究所、CB21/13/00105)、マドリッド、スペイン

オスカー・サラゴサ

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MJGM、OZ、AB、IM、および LMG が研究を設計しました。 MJGM、LGS、SM、MRS、LMG が調査を実施しました。 MJGM、AB、IM、LMG がデータを分析しました。 LMGが論文を執筆した。

ルイス・マルティネス・ギルへの通信。

バレンシア大学は、ウイルス増殖を促進するためのエチニルエストラジオールの使用に関する特許出願を提出した。

適用できない。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

以下は電子補足資料へのリンクです。

。 SARS-CoV-2 S タンパク質誘発性合胞体。 Hek 293T 細胞に、SARS-CoV-2 S タンパク質およびヒト ACE2 コードプラスミド (AC) をトランスフェクトするか、モックトランスフェクト (D) を行いました。 24 時間後、10 倍の対物レンズを備えた Motic AE200 顕微鏡を使用して細胞を視覚化しました。

TMPRRS2 の存在下でのエチニルエストラジオールの毒性。 A および B. エチニルエストラジオールの毒性に対する TMPRSS2 の効果を分析するために、Hek 293T 細胞に TMPRR22 または eYFP をトランスフェクトし、48 時間後に毒性をアッセイしました。毒性は、製造業者の指示に従ってCell-Titer Gloアッセイ(Promega)を使用してATPレベルを測定することによって分析した。点は 2 つの独立した実験の平均を表します。 CC10、CC50、CC90の値が表示されます。

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転載と許可

García-Murria、MJ、Gadea-Salom、L.、Moreno、S. 他ウイルス膜融合を促進できる小分子の同定。 Virol J 20, 99 (2023)。 https://doi.org/10.1186/s12985-023-02068-1

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受信日: 2023 年 2 月 7 日

受理日: 2023 年 5 月 9 日

公開日: 2023 年 5 月 24 日

DOI: https://doi.org/10.1186/s12985-023-02068-1

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